[发明专利]重组生产的干扰素的提纯

说明书

发明领域

本发明涉及由重组生物体生产的干扰素的提纯。本发明特别涉及所需干扰素同工型，例如具有所需二级二硫键结构并缺乏化学加合物的同工型与此类生物体生产的不需要的干扰素同工型的色谱分离。

发明背景

干扰素是表现出抗病毒、抗增殖和免疫调节活性的细胞因子。由于这些活性，不同类型的干扰素已被批准用于治疗疾病，如肝炎、各种癌症和多发性硬化。

干扰素（IFNs）可以根据它们的生物和物理性质分成三大类。在人体中，I型IFNs由五类构成：alpha (IFN-α)、beta (IFN-β)、epsilon (IFN-ε)、kappa (IFN-К)和omega (IFN-ω)。干扰素gamma (IFN-γ)是唯一已知II型干扰素。III型包括IFN-λ。参见，例如，Antonelli, G., New Microbiol. 31:305-318 (2008)。

在人和许多其它物种中表达IFN-α蛋白质的多种亚型，在人体中识别了12种不同的成熟亚型（Bekisz, J.等人, Growth Factors 22(4):243-251 (2004)；Antonelli, G., supra；Pestka, S.等人, Immunol. Reviews 202:8-32 (2004)；Diaz, M.O.,等人, J. Interferon Cytokine Res 16:179-180 (1996))。人IFN-α亚型共享75-99%氨基酸序列同源性和166 a.a.的成熟序列，IFN-α2除外，其由于在位置44处的缺失而具有165 a.a.。一些IFN-α亚型也以变体形式存在，如具有至少3种等位形式的IFN-α2：IFN-α2a、IFN-α2b和IFN-α2c。

I型IFNs共享的最保守特征是二硫键：在IFN-α和IFN-ω中存在2个二硫键，而在IFN-β中存在一个。IFN-α中的二硫键在Cys1-Cys 99(98)和Cys29-Cys139(138)之间，括号中的残基数是指IFN-α2。IFN-β中的单个二硫键在Cys31-Cys141之间。IFN-α Cys29-Cys139(138)和IFN-β Cys31-Cys141键对这些IFNs键合到I型IFN受体复合物上并因此对它们生物活性的保持而言明显至关重要（Bekisz等人，见上文）。

尽管IFNs可以由它们的天然来源获得，但重组技术能够由已用编码所需IFN蛋白质的DNA分子转化的非天然来源，如细菌和其它微生物生产大量的这些蛋白质。重组生物体生产IFNs通常包括多步提纯法，包括在各种介质上的色谱法以除去源自宿主生物体或培养基的污染物以及想要生产的IFN蛋白质的结构同工型。参见，例如，美国专利号US 4765903、US 5196323；欧洲专利号EP 108585、EP 110302；EP 118808和EP 0679718；Staehelin等人, J. Biol. Chem 256:9750-9754 (1981)；和Secher等人, Nature 285:446-450 (1980)。

例如，未提纯和部分提纯的重组IFN-α制品常常含有要生产的IFN-α亚型的结构同工型的混合物。结构同工型可分成三大类：（1）二硫键同工型，（2）化学附加（chemical adjunct）同工型，和（3）具有改变的二硫键结构以及一种或多种化学附加物的混合同工型。二硫键同工型包括各含Cys1-Cys 99(98)和Cys29-Cys139(138)二硫键的氧化IFN-α单体同工型；分别不含一个或两个这些二硫键的部分和完全还原的单体IFN-α同工型；IFN-α单体的片段；和通过分子间二硫键形成的IFN-α低聚物，即二聚物、三聚物和四聚物。含有连接到IFN-α氨基酸链上的一个或多个化学基团的化学附加同工型包括：丙酮酸盐-附加的IFN-α同工型，其中该IFN-α蛋白质的N-末端氨基酸残基的α-氨基与丙酮酸盐的羰基缩合；和甲硫氨酸附加的同工型（国际专利申请公开WO 00/29440；美国专利No. 5,196,323）。重组IFN-α-2b的结构同工型的实例显示在图1中。