[发明专利]核酸纯化方法

说明书

本发明涉及从含核酸的样品中纯化核酸的方法和试剂盒。

现有的技术已公开了各种纯化和分离核酸的方法。包括使用苯酚氯仿、盐析法，使用离子交换剂和二氧化硅颗粒。

已知的核酸纯化方法是“电荷转换法”。所述方法包括使核酸结合相在第一pH值下与含核酸样品接触，在第一ph值下，核酸结合相带正电荷。这有利于带负电荷的核酸与所述相结合。根据电荷转换原理，通过调整第二pH值来释放/洗脱核酸，该第二pH值高于所述核酸结合相的pKa值，以逆转或中和正电荷。这促使结合的核酸从核酸结合相解离。

现有技术已经公开了可溶相(见，例如，EP 0 707 077)和固相(见，例如，WO 99/29703)。各种溶液用以洗脱，例如具有很高pH的溶液或其它生物缓冲液，特别是低盐缓冲液诸如，如Tris缓冲液，以使纯化的核酸立即作进一步处理，例如用于扩增反应或限制性酶消化。

即使当已知纯化核酸的方法合适，仍有需要改进现有方法，特别是以一种特别温和的方法来纯化核酸。

因此，本发明的目标是改进核酸纯化的现有方法。

根据本发明，该目标通过至少包括以下步骤的从含核酸的样品中纯化核酸的方法来实现：

a.将含有核酸的样品与具有核酸结合基团的核酸结合相接触，所述核酸结合基团具有至少一个pKa在9到12的可质子化基团；

b.在比至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的pH值(结合pH)下使核酸结合核酸结合相；

c.在高于结合pH值，但比至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的pH值(洗脱pH)下洗脱核酸。

本发明涉及使用核酸结合相来纯化核酸，所述核酸结合相相应具有核酸结合基团。这种核酸结合基团pKa值为9至12的至少一个可质子化基团。核酸在低于这些可质子化基团中至少一个的pKa值的pH值下结合。所述可质子化基团吸收质子并因此带有正电，导致核酸结合相结合带负电的核酸。洗脱在较高的pH值下实施，从而减少核酸结合相的正电。然而，根据本发明，洗脱pH值低于可质子化基团的pKa值，特别是低至少一个pH单位，优选低至少两个pH单位。这样可使洗脱在温和条件下实施，因而具有相当大的优势。因此与现有技术相反，本发明允许在低于可质子化基团pKa值的pH下实施洗脱。

根据本发明的一个实施方式，核酸在pH值3到8之间结合。这个信息涉及结合过程中及由此样品中的pH值。根据固相的设计，本发明方法也可在非常温和的条件下实施，因此核酸甚至可在pH值为4到7.5，优选5到7.5，特别优选5到7，很特别优选6.5到7的pH值下，因此在实际上中性的范围内结合。由于核酸结合相的可质子化基团的pKa值在9到12，所述基团即使在相对中性pH值下仍带正电，从而足以使得核酸有效附着。因此结合可以在非常温和的条件下实施，以防核酸破坏。

此外，已证明在低盐浓度下实施结合是有优势的。因此，根据一个实施方式，在核酸与核酸结合相结合时所述盐浓度小于1M。所述盐浓度优选小于0.5M，小于0.25M或甚至小于0.1M。为优化核酸与固相的结合，优选低盐浓度。离子浓度过高对核酸和核酸结合相的离子相互作用具有不利影响。我们已发现所述结合缓冲液也可包含一定量的有机物，例如，碳水化合物，醇类，例如乙醇、甲醇或丙酮和乙腈。这些物质不会损害结合。

该方法的另一重要步骤是核酸的洗脱。如所示的，核酸在高于结合pH值的pH值下释放。因此，可质子化基团在洗脱期间带有较小的正电，这有利于核酸的释放。此外，洗脱期间pH值比核酸结合相的至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位。因此，如上所示，洗脱可以在特别温和的条件下实施。

根据所采用的核酸结合基团或核酸结合相，洗脱优选在pH值7.5到11，7.5到10，优选在8到9或8.2到8.8的pH值之间实施。因为核酸以特别温和的方式释放，这些低pH值获得了特别有利的结果。下文描述了使核酸在低pH值下，以特别有效的方式释放而采用的其它措施。

为了使分离的核酸在洗脱缓冲液中立即接受进一步的加工，所述洗脱缓冲液优选具有低盐浓度。因此，根据一个实施方式，盐浓度小于1M，优选小于0.5M，小于0.25M，小于0.1M，特别优选小于50mM，小于25mM或甚至小于10mM。适用的盐可以是碱金属和碱土金属的氯化物或铵盐、其它矿物酸盐、醋酸盐、硼酸盐等以及化合物诸如Tris、Bis-Tris和有机缓冲液，例如MES，CHAPS，HEPES等。此外，现有技术已经描述了适用于洗脱的物质。