[发明专利]用于工程化细胞的组合物和方法

说明书

交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2008年11月14日提交的美国临时专利申请号61/115,013的优先权，其全部公开内容通过引用方式并入本文。

技术领域

本申请大体上涉及细胞的遗传操作和/或重编程。特别地，提供了组合物和方法，它们能够操作任意细胞(例如干细胞)，包括胚胎干细胞、胎儿干细胞或祖干细胞，或者能够重编程体细胞至分化程度较低的状态，朝着更加多能性胚胎干细胞样状态。由此产生的干细胞或干细胞样细胞可用于研究、医学和其它相关领域。

发明内容

本发明涉及分子生物学相关的组合物和方法。在一些方面，本发明提供了用于细胞工程化的核酸分子和方法。

在具体的方面，本发明部分地提供了具有下列组分中的一项或多项(例如1、2、3或4项)的核酸分子(例如，分离的核酸分子)：(a)OriP位点，(b)编码EBNA1的DNA区段；(c)一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8等)重组位点(例如一个或多个att位点)；和/或(d)至少一个可选择标志物(例如，至少一个阳性或阴性可选择标志物，包括至少一个阳性可选择标志物和至少一个阴性可选择标志物)。

虽然在多数情况下，本发明涉及EBV病毒的EBNA1蛋白，但本发明也包括源自其它游离病毒例如腺相关病毒(AAV)、SV40、BSOLV、HIV-1等的任意其它等同的游离体维持蛋白，并且编码这些游离体蛋白的基因和/或它们的OriP元件也可用于产生本发明的载体。

本发明还包括具有至少两项上述组分的两种或更多种核酸分子(例如，本文中的两种载体的混合物，其中一种载体具有OriP位点，另一种载体编码EBNA1；或者细胞系，其包含具有OriP位点的载体，其中细胞染色体编码EBNA1)。这样的两种或更多种核酸分子可以存在于同一组合物中，或彼此分离(例如在不同的载体中，或者在试剂盒的容器中)。

本发明涉及分离的核酸分子，其包含(a)OriP位点和编码EBNA1的DNA区段；(b)一个或多个att重组位点；和(c)编码至少一个可选择标志物的DNA区段。在一个方面，EBNA1的表达可以是组成型的或可诱导的。

本发明还涉及包含一个或多个表达盒的分离的核酸分子，其中每个表达盒与用于表达的启动子可操作地连接，并且可以使用一个或多个att重组位点中的至少一个将每个表达盒导入所述核酸分子中。

在本发明的所有方面中，表达盒可以编码组织特异性基因、干细胞标志物基因或发育基因。

在本发明的所有方面中，干细胞标志物基因选自Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4；Oct3/4、Nanog、SSEA1和TRA1-80。

在本发明的所有方面中，驱动表达盒的启动子选自下列的类型：细胞特异性启动子、组织特性启动子、干细胞标志物启动子、发育基因启动子等。在进一步的实施方式中，启动子可以是哺乳动物来源的天然启动子或工程化的启动子，或细胞特异性启动子或发育阶段特异性启动子。

在本发明的所有方面中，干细胞标志物启动子选自下列启动子：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4；Oct3/4、Nanog、SSEA1和TRA1-80。在一个实施方式中，发育阶段可以是生殖细胞、胚胎、祖细胞、胎儿、新生儿或干细胞阶段。

在具体的实施方式中，哺乳动物是人。

在本发明的所有方面中，可选择标志物可以是荧光蛋白，赋予抗生素抗性的蛋白，或酶。

在进一步的方面，可选择标志物是荧光蛋白。

在本发明的所有方面中，荧光蛋白可以选自：绿色荧光蛋白(GFP)及其修饰的突变体、红色荧光蛋白(RFP)及其修饰的突变体等。

在具体的实施方式中，荧光蛋白是GFP。

在具体的实施方式中，细胞是干细胞。

在本发明的所有方面中，可选择标志物可以是赋予抗生素抗性的蛋白。

在进一步的实施方式中，抗生素可以选自四环素、新霉素、灭瘟素、潮霉素、氨比西林和嘌呤霉素。

在具体的实施方式中，抗生素是潮霉素。