[发明专利]利用质谱法分离、表征和/或鉴定微生物的方法

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求享有于2008年10月31日提交的标题为“Method and System for Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample”的美国临时专利申请第61/110,187号的权益，将其结合于本文中作为参考。

技术领域

本发明涉及用于检测、分离和/或鉴定样品中的微生物的方法和系统。具体而言，本发明涉及利用质谱法快速表征和/或鉴定微生物的直接方法。

背景技术

检测生物学流体中的病原微生物，应该在尽可能最短的时间内进行，尤其是在败血症的情况下，对于该病症尽管医生可利用的抗生素的范围广泛，但是其死亡率仍然保持较高。生物学活性剂(诸如微生物)在患者体液尤其是血液中的存在，一般采用血培养瓶进行检测。血流感染与高的发病率和死亡率有关，然而当前的诊断方法即培养之后进行生物化学鉴定和抗生素敏感性测试，可能要耗费几天时间来进行。通常，基于临床症状开始经验疗法，而只有当初始疗法无效时测试结果才会影响临床决策。在阳性血液培养结果之后的最初几个小时内、优选1个小时内表征血液感染的能力，将会显著地加强所提供的诊断信息的临床相关性。已经提出了分子扩增方法来填补这方面的需要，但是对于这种方法仍然存在严重的挑战。阳性血液培养液自身代表具有用于各种快速、鉴定(ID)试验的潜能的天然扩增的微生物种群。

为了提供稳健的结果，传统的自动表型ID测试(诸如Vitek、Phoenix^TM和Microscan系统)或手动表型测试(诸如API)要求微生物处于适当的生长阶段并且无干涉培养基和血液产物。这些系统利用在平板培养基上从阳性培养液中生长18～24小时的菌落。然而，为了获得更快的结果，一些实验室已经报道了采用这些系统及从阳性血培养瓶中分离的微生物。这些直接获自培养瓶的试验并不是对于所有的微生物(例如，革兰氏阳性球菌)都是适当的，未经测试厂商验证，并且一般要花费3～8小时才能提供结果。迫切需要更快且更广泛的特异性试验，以便在阳性培养结果之后的最初几个小时内、优选1个小时内为医师提供临床上相关的结果。

质谱法具有实现非常快速地鉴定微生物的潜能，但是可能会遇到来自存在于液体微生物培养基中和临床样品诸如血液或其组合中的许多化合物的干扰。直接从阳性血液培养液中回收微生物的最常用的方法是两步差速离心和在血清分离器管中进行的离心。

已经描述了用于分离、表征和/或鉴定微生物的其它方法，包括：

美国专利第6,177,266号公开了一种采用通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析细胞蛋白提取物或整个细胞产生的属、种和菌株的特异性生物标记物对细菌进行化学分类学分类的方法。

在美国专利第7,070,739号中，显示了一种通过二维超离心直接从体液或均质化组织中提取、分离和纯化微生物(包括病毒)的方法。在第一步离心步骤中，将沉降速度高于待鉴定的微生物的沉降速率的所有粒子除去。在第二步超离心步骤中，采用专用锯齿离心管，于填充的流体中应用等密度分带以形成宽范围的密度梯度。根据该专利，分离技术能够用于通过利用核酸特异性染料的光散射或荧光检测分带的粒子，以及用于以非常小的体积回收分带的粒子，从而通过质谱分析病毒蛋白亚单位和完整的病毒粒子以及通过荧光流量细胞计数测定核酸的质量和由限制酶产生的片段的质量进行表征。

美国专利申请出版物第2007/0175278号描述了采用液体培养基培养所关注的样品，包括例如血液、尿液、粪便、脉管导管等，工业生产线，水系统，食物产品，化妆品，药物制剂和法医样品。随后，通过本领域内已知的方法，例如通过离心可以从液体培养基中采集微生物。然后可以将浓缩的微生物转移到载体物质中，可选地在干燥之后，用于获取振动光谱。该专利申请讨论了用于鉴定和分类微生物的各种方法，包括振动光谱法，诸如拉曼光谱法。

然而，这些方法在试图从复杂样品(诸如含血液的培养基)中分离和表征微生物时具有一些缺点。所得的微生物制剂经常包含污染性的红血细胞、血小板、脂质微粒、血浆酶和细胞碎片，这些都可以导致结果变差。这些方法也是非常劳动密集型的并且由于其步骤能够使潜在危险的病原体在空气中暴露于使用者从而是不安全的。仍需要从血液培养液和其它无这些干扰物质并与快速鉴定技术相容的复杂样品中分离微生物的简单安全且可靠的方法。

发明内容