[发明专利]用于制备人重组胰岛素的方法

说明书

本发明涉及生物技术学、基因工程和医学并且可被用于药物生产，特别是用于制造治疗糖尿病的药物。 

胰岛素是由通过3个二硫键(1个链间键(A⁶-A¹¹)和2个链内键(A⁷-B⁷和A²⁰-B¹⁹))连接的21个残基的酸性A链和30个氨基酸的碱性B链[1]组成的蛋白质激素。虽然可成功地在体外重组胰岛素的分开的A链和B链[2]，但在体内通常合成单链多肽(前胰岛素原)。其含有B链N末端处的信号肽和A链与B链之间的C肽。在于内质网中切割N末端信号序列后，所产生的多肽折叠并且作为胰岛素原被包装到分泌颗粒中[3]。由一组特定的蛋白酶进一步加工后，胰岛素原然后被转化为胰岛素并且被分泌到血流中以调节糖水平。 

在商业上，已通过转肽作用产生了人胰岛素，其中用苏氨酸替代了猪胰岛素的B链第30个位置处的丙氨酸残基[4]。由于从猪胰岛素产生人胰岛素受到其高成本的限制，最近的研究已主要集中在通过基因工程技术生产人胰岛素的方法。已利用了3个主要的方法使用微生物进行胰岛素的生产。其中两个方法涉及大肠杆菌(Escherichia coli)，其中胰岛素前体作为更大的融合蛋白的一部分被表达在细胞质中(主要以包涵体的形式)，或者被分泌到周质空间中[5]。第三种方法利用酵母，并且胰岛素前体被分泌到周围的培养基中[6]或形成不溶性包涵体[7]。 

通过基因工程方式制备人胰岛素的方法包括下列步骤：在大肠杆菌中以融合蛋白的形式产生胰岛素原，将融合蛋白重折叠以形成正确的二硫键；用胰蛋白酶和羧肽酶B处理重折叠的多肽；纯化生成物以获得胰岛素。该方法的变型也利用了融合蛋白的磺化作用和溴化氰切割来获得作为胰岛素生产的中间产物的胰岛素原[8]。此外，基因操作使得能够产生在重组蛋白的胰岛素原和/或C肽部分中具有不同氨基 酸含量的的融合蛋白。这些操作被引向增加正确折叠的胰岛素原(前胰岛素原)的产率。然而，具有正确二硫键的重折叠的胰岛素原的产率随着重折叠缓冲液中胰岛素原的浓度增加而降低。这是由于错折叠和一定程度的聚合。因此，重折叠是胰岛素生产过程中的关键步骤。此外，在胰岛素生产的随后步骤中胰岛素的纯化是非常费力的并且通常是高成本的。总之，开发人胰岛素生产的新方法不仅有益于终产品的质量而且还节约资源并为消费者降低产品价格。 

重组人胰岛素生产的公开方法包括包含编码胰岛素原的重组DNA的质粒构建[9]、产生杂合多肽的大肠杆菌菌株的开发和培养、细胞的分离和破碎、杂合多肽的回收和酶促切割，继而分离所需的产物。 

然而，该方法只利用大肠杆菌菌株BL21/pIK8-胰岛素原，其携带单一的质粒DNA pIK8-胰岛素原，因而限制许多宿主/表达载体组合。 

此外，该方法包括在酶促切割之前用柠康酐处理杂合多肽，这加入了额外的纯化步骤并且降低了所需产物的产率。 

本发明的目标在于开发重组人胰岛素生产的方法，该方法保证增加杂合多肽的产率和制造具有高质量的所需产品。 

该方法的主要结果是由于某些制造步骤的简化和消除、终产物产率的数量增加和改善的终产物质量而改进技术的有效性。所有这些益处均归因于表达载体数量的增加、前肽氨基酸序列的优化、重折叠方法的优化和细胞破碎、包涵体洗涤、蛋白质回收及纯化方法的精进。 

所声明的一系列特征与所达到的技术效果之间存在密切的因果关系。 

本发明涉及用于通过培养用编码重组人胰岛素多肽的DNA序列转化的原核宿主而产生重组人胰岛素的改进的方法。在大肠杆菌中合成了包含连接于胰岛素原的前导序列的重组杂合多肽。通过用胰蛋白酶和羧肽酶B处理正确折叠的杂合多肽，以及随后的纯化来产生人胰岛素。根据本发明，可以以良好的重现性制造人重组胰岛素，而蛋白质回收和纯化步骤被显著改善了。 

新的质粒DNA构建体的开发使我们能够扩大所使用的微生物菌株的种类并优化前肽的氨基酸组成。 

本方法中所提出的介由利用快速流动高容量树脂的吸附层析而浓缩杂合多肽的有效技术允许我们显著提高该方法的生产率。 

此外，所提出的方法不存在在酶促切割之前利用柠康酐步骤封闭氨基。为了使脱苏氨酸的形成最小化，在高pH值时进行胰蛋白酶解，因而增加终产物的产率并且省略与citraconilation相关联的额外纯化步骤。 

此外，优化了胰岛素纯化的方法。其包括离子交换层析和反相高效液相色谱，这允许产生98-99％的纯度的胰岛素。