[发明专利]PRE-rRNA比率测量分析

说明书

联邦资助的研究或开发

本文公开的组合物和方法是在环境保护局(Environmental Protection Agency)资助的STAR研究协助协议(STAR Research Assistance Agreement)#FP91698201-0和#R833011下开发的。因此，政府在本发明中可具有一定权利。

技术领域

本发明涉及检测和测定样品中活细胞的存在。更具体来说，本发明涉及检测样品中以非常少的数量存在的活细胞。包括了用于检测样品中作为活微生物的动态指示物的核糖体RNA前体(pre-rRNA)的组合物和方法。

发明背景

微生物例如细菌病原体可能难以从复杂的临床和环境样品中培养。它们可能存在数量少，或处于铺板效率低下的受伤和衰老的生理状态中。样品常常具有在非选择性培养基上生长超过病原体的竞争性微生物菌群，而选择性培养基可能降低收率并针对某些菌株进行选择。大多数基于培养的检测方法需要1-3天才能产生结果，对于许多情况、特别是威胁生命的情况来说太慢。

细菌培养的一种替代方案是核酸扩增检测(NAAT)。最常用的NAAT类型——聚合酶链反应(PCR)，既快速又灵敏。PCR的局限性是它不能将活的病原体细胞与非活细胞、样品中的游离核酸和检测过程中引入的污染核酸区分开。PCR在机械上也是复杂的，并易受样品中物质的抑制。当PCR被用于评估抗微生物治疗、消毒(例如水处理)和净化方法的效力时，这些限制特别成问题。

为了提高用于活微生物的NAAT的灵敏度和特异性，降低或消除非活微生物和游离DNA的假阳性检测将是有价值的。一种方法是检测微生物的RNA而不是DNA。据认为，RNA在溶液和死细胞中不如DNA稳定。用于核糖体RNA(rRNA)或信使RNA(mRNA)的种特异性探针是已知的。然而，微生物的mRNA由于其不稳定性和低丰度而难以检测(Gedalanga和Olson.2009.开发定量PCR方法用于区分环境水样中的活细菌和非活细菌(Development of a quantitative PCR method to differentiate between viable and nonviable bacteria in environmental water samples.)Appl Microbiol Biotechnol.82：587-596)。相反，成熟的rRNA相当稳定，并且能够在死的细菌细胞中坚持长时间。

发明概述

为了提高对活细胞的灵敏度和特异性，可以使用用于微生物rRNA前体(pre-rRNA)的测定方法。Pre-rRNA是rRNA合成中通过多顺反子的rrs-rrl-rrf操纵子转录本的快速溶核切割而产生的中间体。前导和尾部片段随后在与核糖体装配相关的较慢反应中被移除，产生成熟的rRNA亚基。在正在生长的细菌细胞中，pre-rRNA占总rRNA的一个大的部分。Pre-rRNA甚至比细菌中表达最强的mRNA分子都明显更丰富和更容易检测。此外，在营养刺激后，它们的细胞内拷贝数快速增加，这种动态性质有助于解释临界性结果，从而提高了对样品中以非常少的数量存在的细胞进行的检测的功能灵敏度。此外，它们常常具有种特异性序列，便于通过NAAT在复杂样品中对它们进行检测。

正如在本文中所公开的，开发了检测种特异性pre-rRNA分子的NAAT。Pre-rRNA是成熟rRNA合成中的中间体。它们是丰富的细胞组分，具有高度种特异性的核苷酸序列。这使得它们成为在复杂样品中检测微生物病原体的良好的靶。当微生物细胞经历营养刺激时，Pre-rRNA的拷贝数增加几个数量级。这种响应非常快速(＜1个代时)，并且由于受刺激细胞中pre-rRNA的丰富性而易于检测。在受刺激和对照样品中对pre-rRNA进行定量PCR测量得到数值比率。如果为正，这些比率证实了样品中存在完整的、活的病原体细胞。当定量PCR信号非常弱时，正的比率增加了测定结果表示真阳性结果的可靠度。这提高了测定方法的功能灵敏度。

从下面参考附图进行的优选实施方案的详细描述中，其他特点和优点将变得明显。

附图简述