[发明专利]基于PCV 2的用于治疗猪的方法和组合物

说明书

发明背景

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科(circoviridae)的动物病原体，是在哺乳动物细胞中自主复制的最小的一些病毒。病毒粒子呈二十面体，无包膜，直径17nm。近来有两种已得到公认的PCV类型，猪圆环病毒I型(PCV1)和猪圆环病毒II型(PCV2)。PCV1是非致病性的，而PCV2则与多种疾病和综合征有关，包括但不限于断乳后多系统消耗综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)和先天性震颤，这些可以统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。现在已经公认由PCV2引起的疾病在世界上许多产猪地区造成了严重的经济上的影响。

PMWS在产业上具有特别的重要性，它在许多畜群中造成相当水平的死亡率，并给养猪产业带来严重的经济损失。PMWS是仔猪和肥育猪的疾病，特征是生产迟缓、皮肤苍白、呼吸困难、以及死亡率升高。PMWS最初是在1991年在加拿大的一个畜群中被鉴定出来的，目前被公认为是全世界养猪产业中最严重的问题之一。各种临床研究都显示PCV2在PMWS中具有病因学上的重要性。

PCV2包含一个大约1.76kb的单链环状DNA基因组，其中有两个主要的开放阅读框(ORF)(Mankertz et al.，2000)。由病毒基因的ORF2所编码的衣壳蛋白(Cap蛋白)是该病毒的主要结构基因，并且具有类型特异性的表位(Mahe et al.，2000；Nawagitgul et al.，2000)。已经显示，中和性单克隆抗体和中和性猪血清可以与衣壳蛋白反应(Pogranichnyy et al.，2000；McNeilly et al.，2001；Lekcharoensuk et al.，2004)。已经鉴定了PCV2的一个免疫学上相关的ORF2表位是病毒感染的血清学标记物(Truong et al.，2001)。PCV2的血清学分析显示这些病毒能够诱发体液免疫。较长的被动免疫期对于小猪抵抗PCV2感染是重要的，因此被动免疫期越长，越不易显示PMWS的征象(Blanchard et al.，2003a)。这就使得PCV2疫苗的手段成为可能--如果能够设计出这样的免疫接种方法，能在小猪因母体免疫力的断绝对PCV2感染易感的时间点到来之前在小猪体内诱导出免疫力的话。但是，还没有可用的有效疫苗。

猪腺病毒(PAdV)表达系统是一种引人注意的PCV2疫苗生产的候选者。猪腺病毒能够有效复制至高效价，能提供克隆空间，PAdV容许重组蛋白在多种猪细胞系和组织中表达；在相同细胞系或组织中表达多种基因；精确地表达和修饰重组蛋白。某些研究已经利用人腺病毒表达系统表达了PCV2的ORF2蛋白，并且示明了重组腺病毒在小鼠中的免疫原性(Wang et al.，2006)。

然而，虽然有数项利用插入病毒载体并由病毒载体表达的PCV2ORF2基因来引发合适的抗PCVAD保护性免疫应答的尝试，这些尝试都未能产生产业上可行的疫苗。已经发现，虽然PCV2的ORF2是相关疾病的血清学标志物，但当PCV2ORF2被病毒宿主表达用于预防接种目的时，这样的疫苗未能产生足够合适的免疫应答来保护猪只免于疾病。本发明首次确定了导致此失败的一个显著因素，并且提供了若干组合物，它们克服了前人尝试生产基于病毒载体投递的PCV2ORF2的PCVAD疫苗的过程中遇到的相关问题，

发明内容

本发明致力于解决本领域中对于猪治疗用疫苗的需求。具体而言，本发明人发现，为了在病毒载体或亚单位疫苗组合物中有效力，PCV-2ORF2应该以这样的形式提供，使得其或是被受感染细胞所分泌，或者至少被表达在受感染细胞的细胞表面上。

具体地，本发明提供一种重组表达载体，其包含与启动子可操作连接的编码修饰型PCV2ORF2的核酸序列，其中所述修饰型PCV2ORF2中野生型PCV2ORF2的核定位信号已经被除去或者修饰，以容许截短型ORF2蛋白在表达后即被分泌(be secreted upon expression)；或者所述PCV2ORF2中核定位信号已经被除去并代之以疏水性信号序列，该信号序列指导PCV2ORF2表达在受感染细胞的细胞表面上。