[发明专利]修饰型生物素结合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及修饰型生物素结合蛋白。

背景技术

抗生物素蛋白是卵清来源的碱性糖蛋白，其与生物素(维生素H)强烈结合。另一方面，链霉抗生物素蛋白是放线菌(Streptomyces avidinii)来源的抗生物素蛋白样蛋白质，其等电点在中性附近，且不含糖链。这两种蛋白均形成4聚体，1个亚基结合1分子生物素。分子量为60kDa左右。抗生物素蛋白与生物素、或者链霉抗生物素蛋白与生物素之间的亲和性非常高(Kd＝10^-15～10^-14M)，在生物体二分子之间的相互作用中是最强的。因此，抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用广泛应用于生物化学、分子生物学或者医学领域。抗生物素蛋白的等电点大于10，因其高碱性、或者糖链的存在而出现有时与DNA、蛋白质等生物分子非特异性结合的问题。

生物素的分子量小达244，且对pH变化、热也稳定，因而常用作物质的标记。作为生物素化的方法，有使经过化学修饰的生物素结合于蛋白质的氨基、羧基、醛基等各种官能团的方法。这样的生物素化试剂是市售的，利用它们可以将蛋白质、核酸等生物素化。此外，作为蛋白质的生物素化方法之一，有下述方法：以重组蛋白质的形式表达可通过生物体内的生物素连接酶而生物素化的序列与目的蛋白质的融合蛋白质，通过宿主细胞内的该酶将融合蛋白质生物素化。作为这样的生物素化序列，有例如BioEase Tag(注册商标)，其作为在大肠杆菌、果蝇细胞或者哺乳类细胞中以体内(in vivo)生物素化的状态表达蛋白质的系统有市售。

抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白与生物素之间的结合极强，该结合是不可逆的，一旦结合，则基本上无法解离。由于该强结合的缘故，传统的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白无法直接应用于生物素化生物分子的纯化所需的、例如亲和色谱等需要可逆性结合的技术领域。

作为该问题的对策，目前为止已经报告了生物素结合性降低的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白。例如，已经开发出将对与生物素的结合有贡献的酪氨酸残基硝基化而得到的硝基化抗生物素蛋白、硝基化链霉抗生物素蛋白。这些在酸性～中性(pH4～7.5)时与生物素强结合，在碱性(pH10)时解离。硝基化抗生物素蛋白-琼脂糖作为CaptAvidin-琼脂糖有市售。但是，硝基化麻烦，且其效率并非一定。而且，有些情况下，极端的pH变化可能对生物素化蛋白质等造成不良影响。

另一方面，目前为止有实例报告称：通过采用基因工程方法在抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白中导入定点氨基酸突变，降低了对生物素的亲和性。作为降低与生物素的亲和性的方法，有以下两种方法：在形成生物素结合口袋的氨基酸中，对与生物素直接相互作用的氨基酸导入突变的方法；以及对参与蛋白质的亚基之间的连接点的氨基酸导入突变的方法。

对于抗生物素蛋白而言，已经报告了通过对与生物素氢键结合的氨基酸引入突变(Marttila et al.(2003)Biochem J.369：249-254；Laitinen et al.(2003)J.Biol.Chem.278：4010-4014；Laitinen et al.(2001)J.Biol.Chem.276：8219-8224)、或者对与生物素疏水结合的氨基酸引入突变(Laitinen et al.(1999)FEBS Lett.461：52-58；Laitinen et al.(2003)J.Biol.Chem.278：4010-4014)而降低了对生物素的亲和性的重组蛋白质。