[发明专利]通过过表达琥珀酸脱氢酶增加甲硫氨酸生产

说明书

发明领域

本发明涉及通过培养经修饰用于增强涉及琥珀酸脱氢酶合成的基因表达的微生物用于改善甲硫氨酸生产的工艺。将所述微生物以增加甲硫氨酸/碳源得率的方式进行修饰。还请求保护从发酵培养基中分离甲硫氨酸。

现有技术

琥珀酸脱氢酶(琥珀酸氧化还原酶，SQR)是克雷伯氏循环(Krebs cycle)和需氧呼吸链二者的功能成员。SQR催化细菌细胞质中琥珀酸盐至延胡索酸盐的氧化，具有泛醌在膜中的伴随还原。在大肠杆菌(E.coli)和其他细菌中，该酶包含4个亚基。2个疏水亚基SdhC和SdhD将2个亲水和催化亚基SdhA和SdhB锚定至内膜表面。5种独特辅因子涉及琥珀酸盐至延胡索酸盐的氧化。在SdhA中，存在共价附着的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)分子，以通过氢化物转移机制催化琥珀酸盐氧化。电子随后个别地通过电子转移亚基(SdhB)进行转移，所述SdhB含有[2Fe-2S]、[4Fe-4S]和[3Fe-4S]簇。醌结合位点由来自SdhC、SdhD和SdhB的残基形成，允许泛醌还原成泛醇(ubiquinole)。该酶还含有夹在SdhC和SdhD之间的血红素b分子，其不是酶功能必需的(Yankovskaya等人2003，Science 299，700；Cheng等人2008Biochemistry 47，6107)。

氨基酸L-甲硫氨酸是以大量(600000t/an)生产的重要饲料添加剂。生产专一地依赖于化学生物合成，并且需要原油衍生的前体。随着对这些不可再生资源价格越来越大的压力，可持续性工艺得到越来越多的注意。甲硫氨酸的发酵生产因此已成为该化学工艺在经济上可行的替代者。

通过发酵进行的甲硫氨酸生产需要几个前体提供途径的修饰。3个主要途径促成甲硫氨酸生物合成。天冬氨酸盐充当碳骨架的前体，半胱氨酸充当硫供体，并且亚甲基-THF充当末端甲基的供体。此外，天冬氨酸盐衍生的高丝氨酸通过琥珀酰-CoA的活化是甲硫氨酸生物合成中的第一个步骤所需的。琥珀酰-CoA在克雷伯氏循环中生产，并且因此克雷伯氏循环酶的表达增加可以增加甲硫氨酸生产。然而高克雷伯氏循环活性已显示为氨基酸生产的缺点，并且减少克雷伯氏循环酶例如异柠檬酸脱氢酶的活性对于氨基酸生产可以是有利的(WO2007017710Metabolic Explorer，WO2009133063Evonik Industries)。

WO 2009078973(Glycos Biotechnology)和EP 1106684(Evonik Industries)公开了sdh基因的缺失增加氨基酸和工业上感兴趣的其他代谢产物的生产。根据这种技术应当理解减少sdh基因的表达将降低克雷伯氏循环活性并因此降低CO2生产，这继而又应对产物得率具有正面影响。

存在增加由可再生碳源生产的甲硫氨酸得率的需要。与现有技术的教导(琥珀酸脱氢酶的活性减少增加产物得率)相反，发现琥珀酸脱氢酶的表达增加增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。

发明概述

本发明涉及用于在发酵工艺中增加甲硫氨酸生产的方法，其包括步骤：在包含碳源和硫源的合适培养基中培养经修饰用于甲硫氨酸的改善生产的微生物，和从所述培养基中回收甲硫氨酸，其中所述微生物通过增强编码琥珀酸脱氢酶(sdh)的一种或多种基因的表达来进一步修饰。

这一种或多种基因的表达是通过将编码琥珀酸脱氢酶的所述基因的至少一个补充性拷贝插入微生物内增强的。

在本发明的另一个实施方案中，进一步从培养基中分离甲硫氨酸。

本发明还涉及通过过表达琥珀酸脱氢酶而对于甲硫氨酸生产最佳化的微生物，优选肠杆菌科(enterobacteriaceae)、棒状杆菌形细菌(coryneform bacteria)、酵母或真菌。在本发明的工艺中使用的这种微生物允许增加的甲硫氨酸/碳源得率增加。

发明详述

生产甲硫氨酸的微生物

本发明涉及通过培养经修饰的微生物用于在发酵过程中生产甲硫氨酸的方法。根据本发明，术语“培养”、‘发酵’或‘发酵过程/工艺’可互换使用，以指示在含有简单碳源的合适生长培养基上的细菌生长。这种简单碳源通过微生物代谢用于生产甲硫氨酸。