[发明专利]一种POOL FQ-PCR联合检测肿瘤耐药基因的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种Pool FQ-PCR联合检测肿瘤多药耐药基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的方法及其试剂盒，试剂盒采用的特异性引物和探针序列如下：

MDR上游引物：5’-CTGGACAAGCACTGAAAGATAAGA-3’(SEQ ID NO.1)；

MDR下游引物：5’-CAACGGTTCGGAAGTTTTCT-3’(SEQ ID NO.2)；

MDR荧光探针：5’-FAM-TCTGGGAAGATCGCTACTGAAGCA-TAMRA-3’(SEQ ID NO.2)；

MRP1上游引物：5’-CGTTAGAGCCCAAAGTGGAATC-3’(SEQ ID NO.4)；

MRP1下游引物：5’-AGTCGGCGGCGTAATTCTTA-3’(SEQ ID NO.5)；

MRP1荧光探针：5’-FAM-TGAGGCTGCCCCAAGACTCAGACTTG-TAMRA-3’(SEQ ID NO.6)；

MRP2上游引物：5’-CATCAAAGAAAGTGGAACAGGA-3’(SEQ ID NO.7)；

MRP2下游引物：5’-TGCGTCTGGAACGAAGACTC-3’(SEQ ID NO.8)；

MRP2荧光控针：5’-FAM-CTGTTCCACTTTCTTTGATGAAACAA-TAMRA-3’(SEQ ID NO.9)；

MRP4上游引物：5’-GGTGGCTCAATCCCTTGTTT-3’(SEQ ID NO.10)；

MRP4下游引物：5’-AAGGTGCTGTGAGCGGTCTT-3’(SEQ ID NO.11)；

MRP4荧光探针：5’-FAM-CCATAAACGGAGATTAGAGGAAGATG-TAMRA-3’(SEQ ID NO.12)；

LRP上游引物：5’-GGAGTCACCATGGCAACTGA-3’(SEQ ID NO.13)；

LRP下游引物：5’-TTCTGGTCCAGCACATGGATAT-3’(SEQ ID NO.14)；

LRP荧光探针：5’-FAM-AGTTCATCATCCGCATCCCCCCATA-TAMRA-3’(SEQ ID NO.15)；

BCRP上游引物：5’-CCTCCACCTGTTAGTCCCATTT-3’(SEQ ID NO.16)；

BCRP下游引物：5’-TGGTGCCACAACTCCTTGGT-3’(SEQ ID NO.17)；

BCRP荧光探针：5’-FAM-TCTCCGGCTGCACAGAAGGCATTTC-TAMRA-3’(SEQ ID NO.18)；

GSTs上游引物：5’-GCTCCACTACTTCAATGCACG-3’(SEQ ID NO.19)；

GSTs下游引物：5’-CTTGTCCAAATCTTCTGCAGAT-3’(SEQ ID NO.20)；

GSTs荧光探针：5’-FAM-AGAATGGAGTCCACCCGGTGGCTC-TAMRA-3’(SEQ ID NO.21)；

同时引入人glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)，基因为内标，特异性引物和荧光探针如下：

GAPDH上游引物：5’-CAGGTGGTCTCCTCTGACTTCA-3’(SEQ ID NO.22)；

GAPDH下游引物：5’-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’(SEQ ID NO.13)；

GAPDH荧光探针：5’-FAM-ACACCCACTCCTCCACCTTTGACGC TAMRA-3’(SEQ ID NO.24)。

上述各引物合成后需经过HPLC的方法纯化，各荧光探针均在5’标记有Fam荧光素，作为报告基团，3’标记有Tamra，作为淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的一种Pool FQ-PCR(小池-荧光PCR)联合检测肿瘤多药耐药基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的方法及其试剂盒，用于检测的多个反应管(小池，Pool)，作为一个整体同步进行，各自检测不同的耐药基因，所以称为“小池荧光PCR(Pool FQ-PCR)”，实现了快速准确检测的目的。

3.根据权利要求1所述的一种分型检测试剂盒，根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法，首先要合成cDNA，取上述提取的RNA2μl，加1μl逆转录酶系，7μl逆转录缓冲液，充分混匀后短暂离心，42℃30分钟，后95℃5min灭活逆转录酶。然后每个小池分型检测所用的扩增体系按照如下方式配制：

上游引物(10uM)：1ul

下游引物(10uM)：1ul

荧光探针(10uM)：0.5ul

PCR反应液：     17.5μl

                              

Total           20.0μl

PCR反应液(PCR MIX)包含FQ buffer(由5×FQ buffer经双蒸水稀释为1×作为工作液)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分。其中1×FQ buffer工作液各主要成分和浓度为：50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、50mM KCl、0.01％的明胶等。