[发明专利]一种POOL FQ-PCR联合检测肿瘤耐药基因的方法及其试剂盒

说明书

一、技术领域

本发明属于核酸诊断领域，涉及肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的基因检测的方法，特别是涉及使用一种Pool FQ-PCR(小池-荧光PCR)的方法对肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)基因进行检测，该方法进一步涉及一种检测试剂盒，用于检测肿瘤患者组织、血样等样本中多药耐药基因mRNA，用于对化疗药物产生耐药的辅助诊断及其病人药物治疗的疗效监控。

二、背景技术

肿瘤细胞多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是造成化疗失败的重要原因，耐药的机制虽有很多，但总结起来不外乎是肿瘤细胞内各种耐药相关转运蛋白和酶类量的改变。而这种量的改变是由编码这些转运蛋白和酶类的耐药相关基因过度表达或表达下调造成的。

肿瘤细胞在受到一定的抗肿瘤药作用后，甚至在抗肿瘤药物作用之前产生了针对这种药物及相关药物，甚至无关药物的抗性，称为多药耐药性。狭义的多药耐药性是指由于MDR1基因表达的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)及其MDR相关蛋白(MDR-related protein，MRP)的表达而产生的抗药性。而广义的多药耐药则是指由于MDR、MRP、LRP、TAP、BRCP基因表达以及谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因、拓扑异构酶(TOPO)基因、热休克蛋白(HSP)基因、蛋白激酶C(PKC)基因、癌基因(c-Ha-ras、bcl-2、bcr-abl、erbB-2、fos、jun、MDM-2等)、细胞因子(IL-6、TGFβ、IGF-2等)、抗氧化相关基因、DNA修复基因以及各种化疗药物代谢相关基因的表达引起的对于抗肿瘤化疗药物的抗性。

1.MDR基因

MDR基因是研究最早的耐药相关基因，人类基因组有两种已知的MDR基因：MDR1和MDR3。两者均定位于染色体7q21.1，且编码的蛋白质有80％同源。 MDR1基因编码转运蛋白并呈现多药耐药表型。

MDR转运蛋白中研究最深入的是P-gp，它是由MDR1基因编码的分子量为170kDa的跨膜性糖蛋白。P-gp分子可以分为氨基酸顺序几乎相等的两部分，12个疏水性氨基酸在膜内排列成6对，使P-gp嵌于膜内，在膜外侧的部分连接糖基，在膜内侧亲水区有两个核苷酸结合位点，属于转运蛋白超家族，即ABC(ATP binding cassette family)家族。P-gp的跨膜结构具有通道蛋白的特性，具有能量依赖性药泵的功能。P-gp与抗肿瘤药物结合，同时在其核苷酸结合位点上结合ATP，ATP水解后所释放的能量使药物转出细胞外，结果使药物浓度下降，其细胞毒作用因而减弱或完全丧失，细胞由此产生耐药性，此为经典的多药耐药途径。

恶性肿瘤细胞P-gp表达上调的机制还不十分清楚，MDR1基因表达水平的提高主要是转录水平表达的升高。对蛋白激酶C具有激活作用的因子可以诱导MDR1基因的表达。对于MDR1基因启动子基因区的序列和结构进行分析，发现有一段高度保守的DNA序列可与热休克蛋白结合称之为热休克元件(HSE，heat shock element)，提示MDR1基因的表达水平可能会受到热休克蛋白的调节。还有研究显示细胞因子、肿瘤抑制基因P53及其突变体对MDR1基因的表达也具有一定的调节作用，而且还具有细胞种类的特异性。

2.MRP基因

自从第一个MRP基因，即MRP1被分离以来，其余几种同源基因也相继被发现，包括MRP2(cMOAT)、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、MRP7、MRP8、MRP9和MRP10。MRP位于染色体16p13.12-p13，编码一种具有1522个氨基酸的蛋白质，此蛋白质被称为多药耐药相关蛋白。其分子量为190kDa，故又被称为P-190。与P-gp相似，MRP上有ATP结合位点，两者同属于ATP依赖性跨膜转运蛋白类，即ABC超家族的成员。不过P-gp与MRP又有许多不同之处：P-gp主要分布于胞膜，而MRP则分布于胞膜和质膜；P-gp是将胞内药物排出胞外，降低细胞内药物浓度，而MRP除部分将药物排出胞外之外，还使胞内药物重新分布，从而呈现MDR表型。