[发明专利]一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备蛋白质的方法，具体地，本发明涉及一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法。

背景技术

已证明转基因植物种子合子胚是药用活性蛋白的极佳来源(Hood etal。2003，Horn et al。2004)，其原因包括胚胎中高蛋白含量，天然拥有蛋白酶抑制剂，且在成熟的种子中能降低总体代谢活动，并能导致外源蛋白保持长期稳定性的低水份含量。大规模生产药用蛋白要求转基因作物种植在开放的田间，因为大棚种植昂贵因而受到局限。在开放的田间种植此类作物要求政府统一集中监测和批准，而且对于转基因产品的可能逃脱监管区域而进入到食物链还存在极大的争议.

对此的解决办法是在大型生物发酵罐中通过细胞悬浮培养液形式生长转基因植物细胞或组织。这种解决办法有许多优点(Hellwig et al。2004)。这些优点是：(1)从接种，收成到过程处理完全在密封的容器中进行；(2)气候和季节不构成影响产量的因素，这意味着药用蛋白质的生产可周年进行；(3)处理废弃生物质简单且便宜；(4)发酵罐生物反应器系统对制药企业来讲比田间生产系统更容易被接受；(5)商用转基因生产系可以采用细胞库，采用低温贮藏办法。

但是，生物反应器系统生长转基因植物细胞用于生产异性蛋白，特别是药用蛋白的可见的弱点在于：(1)从历史角度看，产率低(Hellwig etal.2004)，(2)使用较小规模生物反应器所带来的较高的成本(Hood et al，2003)；(3)必须马上处理，因为不可以放置较长时间。

因此，本发明寻求对这些问题的解决并改进制备蛋白质的方法。

发明内容

除非特别说明，在本文中，所使用的术语“胚性细胞组织”或“胚性体细胞组织”，是指还没有形成胚胎器官如双极胚胎结构(可分化幼苗和根部)以及子叶(子叶可能是或不是某个特定植物种类胚胎器官组成部分)的细胞组织。

除非特别说明，在本文中，所使用的术语“体细胞胚”，简称“体胚”，是指胚性体细胞在培养液中生长发育一段时间后形成的物质，其可能形成不了成熟的具有器官或类似器官结构的胚胎，如子叶或胚根，但却仍然具有成熟器官的特性，即蛋白含量高，具有蛋白酶抑制剂，干物质含量高和水份含量低，并能使外源蛋白保持长期稳定。

本发明的目的在于，提供一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法。

本发明的另一个目的在于，提供用于制备蛋白质的胚性细胞组织。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种制备蛋白质的方法，所述方法是通过将含有需要制备的蛋白质基因转化到植物胚性细胞组织中进行培养来制备蛋白质的。

优选地，所述方法包括以下步骤：1)制备植物胚性细胞组织；2)将需要制备的蛋白质基因转入步骤1)所制备的胚性细胞组织中；3)培养步骤2)得到的胚性细胞组织，使其发育成熟为体细胞胚；4)从步骤3)得到的体细胞胚中提取蛋白质。

优选地，所述步骤1)中制备植物胚性细胞组织的方法包括采用半固体培养基诱导和液体培养基增殖的步骤；优选地，所述培养基为添加了1-20μmol/L生长素和/或1-20μmol/L细胞分裂素的1/2 Litvay(LV)培养基；更优选地，所述的培养条件为：20-30℃，黑暗，90-120转/分钟摇床培养。

优选地，所述步骤2)中将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞组织的方法选自：微粒-介导传递技术(基因枪转化)、原生质电穿孔方法、聚乙二醇析出技术、直接基因转移技术、生物体外原生质转化技术、植物细胞原生质或胚性愈伤组织显微注射技术和土壤农杆菌转化方法；更优选地，所述步骤2)中是通过微粒-介导传递技术和土壤农杆菌转化方法将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞组织。

优选地，所述步骤2)中获得的转基因胚性细胞组织是通过超低温液氮冷冻技术并以细胞库的方式保存，转基因胚性细胞组织的细胞先被制作成种源细胞库(master cell bank，MCB)，然后用种源细胞库的细胞制作工作细胞库(working cell bank，WCB)。

优选地，所述方法还包括在超低温下冷冻保藏所述步骤1)中制备的胚性细胞组织或步骤2)中制备的转入蛋白质基因的胚性细胞组织的步骤；更优选地，所述冷冻保藏温度为-196℃。

优选地，所述步骤3)中培养胚性细胞的方法包括采用液体培养基悬浮培养的步骤；优选地，所述培养基为添加了生长抑制剂如5-120μmol/L脱落酸和/或渗压剂如蔗糖的1/2 Litvay培养基；更优选地，所述的培养条件为：20-30℃，黑暗，60-120转/分钟摇床培养。