[发明专利]一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒 神经毒素的组合分离纯化方法。

背景技术

眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的一种天然毒蛋白，其化学成分非常复杂， 含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性，其 中主要的有神经毒素、细胞毒素、神经生长因子和眼镜蛇毒因子(CVF)等。 随着现代生物技术的发展，眼镜蛇毒的许多组分已得到分离纯化和序列测定， 各种成分广泛应用于生物化学、分子生物学、毒理学和药物学理论研究和临床 应用。

自1933年Monaelesser和Taguet首次报道眼镜蛇毒对癌组织压迫神经引起 疼痛的病例的显著疗效以来，眼镜蛇毒的镇痛作用得到了深入的研究，其中眼 镜蛇毒神经毒素(neurotoxin，NTX)显示了独特的镇痛作用，NTX的镇痛机理 与吗啡类似，镇痛效果大于吗啡，持续时间长，无麻醉作用，无成瘾性和耐药 性，但起效较吗啡慢；同时NTX还能戒除吗啡毒瘾，所以在癌痛或戒毒等方面 具有独特的治疗作用。

目前蛇毒神经毒素的提取方法主要是采用离子交换法结合凝胶层析法，现 有技术的提取方法存在步骤多、分离周期长、提取成本高，蛇毒一次提取之后 不能重复利用等问题。例如：李泛珠等所公开的《浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素 的分离纯化及其镇痛作用研究》(中国药师，2004，7，9，659-661)中，采用三 次柱层析，步骤多、耗时长、提取成本高，不易作为工业化大规模分 离纯化工艺；龚潮梁等所公开的《一种分离提纯眼镜蛇神经毒素的简 便方法》(1981，2，4，83～87)中，采用CM-纤维素柱吸附并线性洗 脱，CM--纤维素树脂允许的线性流速很低，并且极易被压缩，造成 工艺耗时长，产品质量不稳定，属于应淘汰的旧工艺。

眼镜蛇毒因子(Cobra venom factor，CVF)，又称为眼镜蛇抗补体 蛋白(Cobraanticomplementary protein)，是来源于眼镜蛇科蛇毒的一种 旁路补体激活物。由于CVF既能激活补体又能最终耗竭补体，且性质 稳定，特异性高，因此被广泛应用于基础医学的研究.具有广阔的临 床应用前景，可能用于以下几个方面：研究抗补体作用的工具药；用 于抗炎症及抗自身免疫性疾病；抗移植排斥反应；抗肿瘤导向药物等。

由于CVF在眼镜蛇毒中含量甚般，提取较困难，所以很少有公开 报道的CVF分离提纯方法，叶春玲等曾公开《一种从蛇毒中分离提纯 抗补体因子的简便方法》(中国药理学通报，1997Feb；13(1)：85～ 87)，采用先凝胶层析再离子交换层析两步层析法分离，凝胶层析采 用Bio-gel P200柱，离子交换层析采用DEAE cellulose DE 52柱，该方 法可以少量制备样品，但以上两种填料刚性较差，层析柱易压缩，耗 时长，不适合做规模化生产工艺，并且大部分蛇毒蛋白未能有效利用。

发明内容

本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种同时分离眼 镜蛇毒神经毒素和眼镜蛇毒因子、分步得到重点产品、减少产品间的 相互干扰、避免了脱盐引起CVF的溶解度降低而带来的溶液浑浊且容 易蛋白变性的问题、综合利用率和提取效率高、产品纯度高、适合工 业化生产的眼镜蛇毒因子和眼镜蛇神经毒素的组合分离纯化方法。

本发明的目的是这样实现的，一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经 毒素的组合分离纯化方法，其特点在于该方法包含以下步骤：

1)、取蛇毒溶解于纯化水或pH5-8的Tris缓冲液中，10℃以下低 温离心，取上清液，过微孔滤膜；

2)、将步骤1)所得到的上清液进行超滤并交换为分离缓冲液， 采用截留分子量为3kDa-5kDa的超滤膜进行；

3)、将步骤2)所得到的蛇毒液分别进行离子交换层析和凝胶层 析，取相应组分进行除盐浓缩、冷冻干燥，分别得到纯化的眼镜蛇毒 因子和眼镜蛇毒神经毒素成分。

为了进一步实现本发明的目的，可以是所用蛇毒为眼镜蛇毒干粉 或冻干粉。

为了进一步实现本发明的目的，可以是所述步骤1)中，采用0-10 ℃低温离心，上清液过0.22μm或0.44μm微孔滤膜。

为了进一步实现本发明的目的，可以是所述步骤2)中，交换的 缓冲液为pH5-8之间的Tris-HCl缓冲液或醋酸盐缓冲液或PBS缓冲 液中的一种，超滤采用截留分子量为3-5kDa之间的超滤膜系统。