[发明专利]一种猪羊水干细胞系的建立及检测方法

权利要求书

1.一种猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于：该方法包括以下步骤 ：

1）羊水干细胞的原代分离培养；具体实现方式是：

1.1）收集怀孕母猪的羊水，连同子宫带回，无菌打开子宫，分出由胎 衣完整包裹的羊水备用，测量胎儿的大小，详细记录，然后抽取羊水 ；

1.2）用100目滤纱过滤，以除去较大的组织碎片，然后2000r/min，离 心10min，弃上清，收集细胞；

1.3）将步骤1.2）中所收集的细胞加入含有5%血清+5%双抗的PBS溶液 中，混匀，置38℃，5% CO2培养箱中处理10分钟，然后离心，收集细 胞，重复3次；

1.4）将分离出的猪羊水细胞加入原代羊水细胞培养液接种于不同的培 养皿中，置于38℃、5%CO2培养箱中培养；

所述原代羊水细胞培养液是α-MEM+15%  FBS+10ng BFGF+2mmol/L 谷胺酰胺+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素的培养液；

2）将分离培养的原代羊水干细胞进行机械分离纯化；

3）将分离纯化后的羊水干细胞进行培养和检测，建立猪羊水干细胞系 ，其具体实现方式是：

3.1）待分离纯化后的羊水干细胞长至融合时，弃去培养液，用PBS洗 2-3遍，然后用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA细胞消化液在38℃条件下消 化3-4分钟；

3.2）等量细胞培养液中止消化；

3.3）将经过消化的羊水干细胞在1000r/min 离心5-10分钟；

3.4）弃上清，计数，调整细胞浓度为1.0×10⁵个／ml将细胞悬液接到 培养皿上，加细胞培养液； 

3.5）连续培养4-8代后，上皮样细胞逐渐减少消失，90%以上表现为成 纤维样细胞,细胞大量扩增，即建成羊水干细胞系。

2.根据权利要求1所述的猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于：所述 步骤2）的具体实现方式是：

2.1）将分离出的羊水细胞加入原代羊水细胞培养液三天后，观察细胞 生长情况，并记录原代细胞贴壁时间及贴壁细胞数；

2.2）五天后观察细胞生长情况，并半量换液；

2.3）在显微镜下用笔在培养皿上标记出上皮样细胞克隆的区域；

2.4）吸去培养液，用PBS洗1-2遍；

2.5）用细胞刮刀将上皮样细胞克隆刮掉，不要刮到成纤维样克隆，然 后补加培养液，继续培养；或者用细胞刮刀将成纤维样克隆刮下，接 到新的培养皿中，继续培养。

3.据权利要求1所述的猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于：所述步 骤3.4）中的细胞培养液是α-MEM+10% FBS+2mmol/L谷胺酰胺+100u/ ml青霉素+100u/ml链霉素的培养液。