[发明专利]一种猪羊水干细胞系的建立及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞系的建立方法，尤其涉及一种猪羊水干细胞系的建立方法。 

背景技术

由于胚胎干细胞的研究受到伦理道德问题的束缚与限制，很多研究者都在尝试寻找新的干细胞来源。2003年，Prusa等在羊水中发现OCT4阳性细胞，表明羊水中可能存在多能干细胞。2007年，Anthony等于Nature Biotechnology杂志上报道，他们找到了易于获得并有很强增殖能力的干细胞新来源。研究人员通过筛选并分离孕中期羊水中的CD117阳性细胞，得到少量具有胚胎干细胞特性的细胞。他们将这类细胞命名为羊水源干细胞(Amniotic Fluid Stem Cell，AFS细胞)，包括胎儿皮肤、胎盘的羊膜、胎儿消化道、呼吸道、泌尿生殖道的黏膜及上皮细胞。AFS细胞表达CD117表面标记蛋白，该蛋白是干细胞因子的细胞表面受体，在配子发生、黑素形成和造血细胞发生等过程中起重要作用。人胚胎干细胞、原始生殖细胞和一些成体干细胞如神经嵴细胞等，都表达CD117表面标记。实验结果显示，与ES细胞一样，AFS细胞可在体外长期培养，而普通的体细胞在体外只会存活一段时间，随后便会死亡。AFS细胞表达Oct4，且表达部分胚胎干细胞和成体干细胞标记，因此，研究人员认为，AFS细胞处于ES细胞和成体干细胞的中间状态。 

目前，已经证实羊水来源的干细胞具有向多种细胞分化的能力：例如采用地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞；地塞米松、维生素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞；地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β等诱导其分化为软骨细胞；成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导其分化为神经系细胞，并证实了分化后的神经细胞能够分泌释放多巴胺。 

台湾学者Tsai等，通过两步培养法成功地从孕中期羊水中通过贴壁培养分 离出具有多潜能间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，具有神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的特性，在特定的诱导条件下可分化成脂肪细胞、成骨细胞及神经细胞；国内学者李现铎等，分离出MSCs并诱导成平滑肌和脂肪细胞。王晗学者等分离人的羊水干细胞并诱导分化已得到类似于早期心肌细胞的分化细胞，表达α-actin、Tbx5、Nkx2.5、GATA4、α-MHC等心肌特异标记基因。 

猪是我国重要经济动物，而且是人类器官移植的最理想动物，PAFS细胞医学应用的优势在于它很容易获取。研究结果表明，PAFS细胞既可从产前诊断的羊水中提取，也可以从产后的羊水中分离得到，而且抽取羊水过程并不会损害母体。因此，猪羊水来源的干细胞为组织工程提供了一个新的种子细胞来源。 

重要的一点是猪以及很多动物的ES细胞至今尚未建系，而羊水细胞是接近于ES细胞的一种干细胞。我们可以利用羊水细胞代替ES细胞开展许多研究工作，为动物的遗传育种，拯救频危动物提供了极大的便利。并在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因动物等方面有着重要的意义。 

国内关于羊水干细胞的研究刚刚起步，还存在大量空白，仅在人羊水细胞分离培养，研究进展等方面见到零星报道。关于羊水中细胞的类型、不同类型细胞的分选及羊水细胞的诱导分化等问题，还有待于进一步探索。关于猪的羊水干细胞的分离培养及定向诱导分化研究，在国内外均为见到报道，有很大的研究价值及研究前景。 

发明内容

为了解决背景技术中所存在的技术问题，本发明提供了一种快速、有效、安全、分离猪羊水干细胞的方法，可为组织工程研究提供新的种子细胞来源以及有望作为种子细胞从事科研和生产应用。 

本发明的技术解决方案是：一种猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于：该方法包括以下步骤： 

1)羊水干细胞的原代分离培养； 

2)将分离培养的原代羊水干细胞进行机械分离纯化； 

3)检测并将分离纯化后的羊水干细胞进行培养，建立猪羊水干细胞系，其 具体实现方式是： 

3.1)待分离纯化后的羊水干细胞长至融合时，弃去培养液，用PBS洗2-3遍，然后用0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA细胞消化液在38℃条件下消化3-4分钟； 

3.2)等量细胞培养液中止消化； 

3.3)将经过消化的羊水干细胞在1000r/min离心5-10分钟； 

3.4)弃上清，调整细胞浓度为1.0×10⁵个/ml将细胞悬液接到细胞培养皿上，加细胞培养液；