[发明专利]一种无假阳性平末端克隆载体及制备方法无效
| 申请号： | 201010019381.X | 申请日： | 2010-01-14 |
| 公开（公告）号： | CN101818164A | 公开（公告）日： | 2010-09-01 |
| 发明（设计）人： | 蓝东明;王永华;杨博;王文凯;杨宁;吴建华;王小宁 | 申请（专利权）人： | 华南理工大学 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/66 |
| 代理公司： | 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 | 代理人： | 裘晖 |
| 地址： | 510640 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 阳性 末端 克隆 载体 制备 方法 | ||
1.一种无假阳性平末端克隆载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
是用高保真DNA聚合酶扩增模板载体，纯化所得PCR产物即为无假阳性平末端克隆载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述模板载体为线性化载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述模板载体为现有载体，或在现有载体的基础上引入了预设的酶切位点和/或引物序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述现有载体为pBlusctit IISK。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将来源于酿酒酵母的intein基因克隆进载体pBlusctitII SK，得pBlusctitII SK-intein；
(2)双酶切pBlusctit II SK-intein，并进行纯化得模板载体；
(3)使用高保真DNA聚合酶，PCR扩增模板载体，所得PCR产物经纯化后即为无假阳性平末端克隆载体pBSK-blunt。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述双酶切是NotI和EcoRI双酶切。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述PCR扩增使用如下引物：
R7：5’-GAATTCTCCCTTTAGTGAGGGTTAAT-3’，
R3：5’-GAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’。
8.根据权利要求5所述的的方法，其特征在于：步骤(2)或(3)所述纯化为凝胶电泳纯化或是使用PCR纯化试剂盒纯化。
9.一种无假阳性平末端克隆载体，就是由权利要求1-8中任一项所述方法制备得到的。
10.一种无假阳性基因克隆方法，其特征在于：包括将末端磷酸化的平末端目的片段与权利要求9所述载体连接的步骤。
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