[发明专利]一种无假阳性平末端克隆载体及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种载体构建的方法，特别是涉及一种无假阳性平末端克隆载体及其构建方法。

技术背景

随着大规模测序技术的发展，越来越多的物种的基因组序列被测定，为了进一步对未知基因的功能进行研究，需要对所研究的基因进行克隆为下一步的研究提供可能，因而高效的基因克隆技术应用显得的尤为重要。常规的基因克隆技术，应用含有限制性内切酶识别序列的引物通过聚合酶链式反应(PCR)对目标基因进行扩增，并对所获得的PCR扩增产物进行相应的限制性内切酶处理，并连接到相应限制性内切酶处理过的载体中，从而获得保存该基因的载体。但这种方法步骤繁琐，且受基因序列和限制性内切酶识别序列的限制。

在PCR反应的过程中，会在PCR扩增产物的3’末端多增加一个腺嘌呤碱基，这是因为非保真性的Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的功能。根据这一特性，开发出一种能克隆3’末端含有腺嘌呤碱基的PCR产物的在3’末端含有胸腺嘧啶的载体，称之为T载体。由于无需对PCR产物进行限制性内切酶处理，相对于常规克隆方法省略了多个处理步骤，且能同时高效地克隆多个PCR产物，因而这种T载体克隆技术广受人们的青睐。

制备T载体载体的方法主要有两种：(1)平末端载体加T法：应用能使克隆载体产生平末端的限制性内切酶(如EcoRV)进行处理，然后通过末端转移酶或者Taq DNA聚合酶将脱氧胸腺嘧啶(dTTP)添加到线性平末端克隆载体的3’末端，而形成T载体。(2)限制性内切酶处理法：将串联的两个特定的限制性内切酶(如XcmI，AhdI)识别序列引入到克隆载体中，通过酶切处理，产生线性化的载体的3’末端含有单个突出的胸腺嘧啶，而成为T载体。

虽然T载体克隆技术应用非常广泛，但也存在较多不如人意的地方。如平末端载体加T法中，存在对平末端载体加T不充分的情况，这导致了产生严重的载体自连现象，增加筛选阳性重组子的难度。通过限制性内切酶制备T载体的方法，由于存在不完全酶切的情况出现，同样也会导致自连现象的存在。尽管T载体含有可以通过IPTG诱导转化的克隆表达β半乳糖苷酶在底物X-gal上产生蓝白斑进行筛选的功能，但这些试剂价格比较昂贵，同时即使采用这种方法筛选得到的白斑克隆也可能是假阳性。

在使用非高保真的Taq酶进行PCR扩增，由于Taq酶缺乏校正功能，扩增出来的PCR产物存在突变的可能，因而为了序列的保真性，通常会选用保真性好的DNA聚合酶，如pfu。通过高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物的3’末端不存在多余的腺嘌呤，所以如果应用T载体进行克隆此类的PCR产物需要通过对PCR产物进行加A反应或者使用平末端的克隆载体。平末端载体制备一般是通过使用能使克隆载体产生平末端的限制性酶进行酶切，线性化的克隆载体通过磷酸酶处理去掉5’端的磷酸基团。同时，如果线性化载体去磷酸基团不彻底也会产生载体自连的现象，增加筛选阳性克隆工作。现今，使用的克隆载体不论是T载体还是平末端的载体，由于其载体的5’端都含有磷酸基团，因而在连接的过程中都存在载体自连的风险。因而使用5’端不含有磷酸基团的克隆载体可以避免以上的不足之处。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的目的首先是提供一种无假阳性平末端的克隆载体的制备方法，该方法获得的克隆载体可以高效地克隆磷酸化的平末端PCR产物或者其他磷酸化的平末端核苷酸片段。

本发明的目的还在于提供由上述方法制备得到的载体。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种无假阳性平末端克隆载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

是用高保真DNA聚合酶扩增模板载体，纯化所得PCR产物即为无假阳性平末端克隆载体。

所述模板载体为现有载体(例如pBlusctit II SK)，或在现有载体的基础上引入了预设的酶切位点和/或引物序列。所述引入序列可以是以克隆的方法将目的片段连入现有的载体。这样做的好处是：例如引入酶切位点方便检测克隆的片段，而引入引物序列是为了达到更好的扩增效果，诸如此类。

所述高保真DNA聚合酶，应具有3′-5′外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，所得扩增产物为平末端且5’末端不存在磷酸基团，如pfu或其他具有类似功能的DNA聚合酶。

作为优选，所述模板载体为线性化载体，主要是因为线性模板扩增相对比较容易。

本发明以pBlusctit II SK为典型，具体提供了一种无假阳性平末端克隆载体pBSK-blunt的制备方法，包括以下步骤：