[发明专利]乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒，具体涉及一种应用乳胶粒子增强技术提高转铁蛋白浓度检测的灵敏度，可用于尿液中低浓度转铁蛋白的检测。

背景技术

肾小球滤过膜对蛋白质滤过有两种屏障，即体积屏障和电荷屏障。滤过膜滤过孔径的大小决定了体积屏障；电荷屏障的产生是由于肾小球滤过膜富含带负电荷的结构成分，使带负电荷的蛋白质难以滤过，转铁蛋白属此类蛋白质。已有证明一旦肾小球疾病，肾小球滤过膜中带负电荷成分涎酸和硫酸肝素含量减少，此时电荷屏障受损使带负电荷的蛋白质易于滤出，从而进入肾小囊并从尿能够排泄。

目前临床常用检测转铁蛋白的方法为免疫比浊法，此方法以其快速，简便可靠，可在各型自动生化分析仪上使用的特点而在临床广泛应用。但是其检测范围通常在2-15g/L，只能用于检测血清中转铁蛋白的浓度(参考范围：2-3.6g/L)，而难以检出尿中的转铁蛋白浓度水平(尿液转铁蛋白参考范围：0-0.2mg/L)。如能开发出可在自动生化分析仪上使用的免疫比浊试剂盒用于检测尿液中低浓度范围的转铁蛋白，将为临床早期检测肾病发生提供有力的实验依据。

发明内容

本发明就是为了解决上述问题，通过研究乳胶粒子增强的方法，提高检测的灵敏度，从而解决临床没有可常规检测尿液转铁蛋白手段的问题，提供一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒。该发明适用于临床进行常规检测尿液转铁蛋白检测。

本发明研究选择合适的乳胶粒子，及转铁蛋白抗体和乳胶粒子共价结合的合适途径，建立低浓度转铁蛋白水平下和已结合乳胶粒子的转铁蛋白抗体反应形成340nm-700nm可检测的浊度反应体系，包括反应必需的合适的缓冲液，pH和离子强度等。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的包括乳胶粒子、转铁蛋白抗体和缓冲液；转铁蛋白抗体和乳胶粒子共价结合的合适途径，建立低浓度转铁蛋白水平下和已结合乳胶粒子的转铁蛋白抗体反应形成在340nm-700nm检测的浊度反应体系。

一种乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、乳胶粒子的活化

①取1000μl兔抗人转铁蛋白抗体加入2000μl 20mM磷酸缓冲液，pH7.50，混匀备用；

②取600μl 10％20-40nm乳胶粒子，离心4℃21000rpm 90min，弃去滤液；

③加入1000μl 10mM磷酸缓冲液，pH6.00用超声清洗剂溶解粒子，离心清洗两次；

④用3000μl 10mM磷酸缓冲液，pH6.00溶解乳胶粒子，使乳胶粒子活化浓度为2％；加入0.036g N-羟基琥珀酰亚胺，使反应浓度达到12mg/ml；0.060g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，使反应浓度达到20mg/ml；

⑤室温振荡15min；

⑥4℃高速离心60min，弃去滤液；

⑦用3000μl 2mM盐酸冰浴溶解乳胶粒子，4℃高速离心清洗90min，立刻用于结合；

(2)、转铁蛋白抗体和乳胶粒子的结合

①加入兔抗人转铁蛋白抗体缓冲液，使乳胶粒子结合浓度为2％；

②室温振荡2hr；

③4℃高速离心60min，分离滤液，保存滤液；

④用3000μl 20mM磷酸缓冲液，pH7.50，溶解乳胶粒子，高速离心清洗，制成保存溶液，立刻用于保存；

(3)、保存

①加入3000μl保存溶液，pH7.50溶解乳胶粒子，使乳胶粒子保存浓度为2％；

②混匀，4℃保存，用于稳定。

所述高速离心是21000rpm离心。

其中，所述室温振荡的频率为2000次/分钟。

其中，所述室温是指温度不高于30℃。

本发明的有益效果：

此试剂盒可用于检测尿液中浓度范围为0-12mg/L的尿液转铁蛋白水平，准确度可溯源到CRM470【CRM是英语Certified Reference Material(认可的参考材料)的缩写，CRM 470是14个(血清)蛋白分析物的参考制品】，精密度＜10％，从而满足临床的需要。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

(一)抗转铁蛋白抗体包被乳胶粒子