[发明专利]一种用于杂交捕获检测基因组整合型病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种用于杂交捕获检测基因组整合型病毒的试剂盒。

背景技术

病毒脱氧核糖核酸整合到人体细胞基因组中是感染的后期事件。常见的病毒整合现象可以分为两大类，一类是脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，缩写DNA)病毒的整合，比如：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，缩写HBV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，缩写EBV)、腺相关病毒(Adenovirus-associated virus，缩写AAV)和人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，缩写HPV)；另一类是核糖核酸(ribonucleic acid，缩写RNA)病毒的整合，比如：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，缩写HCV)和人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus，缩写HIV)。DNA病毒整合主要借助细胞内已有表达的整合酶或转座酶类实现，它们中一些需要等到细胞分裂时才能开始整合过程。RNA病毒的整合则要更复杂一些，它们先逆转录成DNA形式，然后才能在自身整合酶介导下，插入人类基因组中。

病毒基因组整合将导致长期感染发生，这种情况下宿主细胞无法通过细胞内酶降解外源性DNA的方式，或以细胞分裂、增殖、凋亡等病理机制清除已经侵入的病毒，故感染不易消退。而且，病毒携带的癌基因还会使细胞获得无限制繁殖能力。这使有丝分裂过程中，细胞经常出现染色体复制结构和数量异常。因此，当病毒DNA长期留存时，受感染细胞就会逐步转化为癌细胞。由病毒整合而导致癌症发生的现象对于人类来说是十分常见的，比如：绝大多数肝癌、鼻咽癌和宫颈癌都是在病毒整合进入细胞基因组后才逐步引发的；血液系统淋巴瘤和白血病，也与多种亲造血细胞病毒的基因组整合有关。所以，当我们注意到了病毒整合早于癌细胞发生的事实，并且认识到了病毒整合后，其对细胞基因组持续诱变作用是癌症产生的主要原因，就会理解到这一点：及时了解受感染的细胞中有否存在病毒的基因组整合事件，会为临床恶性肿瘤的防治工作提供具有非常重要价值的预警信息。

然而，现在用于检测整合型病毒的技术并不多，其关键在于如何获得病毒DNA与人类基因组DNA存在共价联结证据。从工作原理来说，目前检测方法大致分可以为三类：1)利用人基因组上已知的某些高度重复DNA序列和病毒已知DNA序列，设计引物对，进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，缩写PCR)，以此证明病毒DNA与人基因组之间的物理连续性。2)利用病毒基因组限制性酶切片断长度的变化，以判断病毒整合是否发生。具体的操作原理和方法是：先以限制性内切核酸酶消化整合型病毒DNA。由于酶解片段如携带人基因组DNA成分，则其长度必然大于正常。因此，当发现异常增长的基因组限制性片段后，则意味着病毒已经完成基因组整合。3)建立细胞基因组文库，然后对其中含有病毒基因成分的文库克隆测序鉴定，若测序结果中出现病毒基因和人基因的嵌合型序列，且交界部位清晰可辨，则可以直接证明病毒DNA整合存在的事实。

上述三种方法都有一定的缺陷，简要说明如下：

1)PCR方法是以人类基因组上的已知序列为扩增基础的，因此要求供引物结合的人DNA序列属于多拷贝基因家族，结构相似，数量众多，且在人基因组中分布均匀。已知符合该条件的各基因家族中，以Alu序列最为合适，其拷贝数达到100万个，但其分布仍不够均匀，相邻区域间常存在大跨度空白区，均大于普通PCR技术所能扩增到达的DNA片段长度。而且，即便在密集分布区，也有多拷贝Alu串联、倒位现象发生，常导致无效扩增得发生。可以说，这种方法对整合型病毒的检测灵敏度和特异性是有限的。

2)限制性酶切方法虽然在灵敏度和特异性方面都可以达到一个比较高的检测水平，但其先决条件是能够获得单克隆细胞系，而且，细胞数量至少需要达到10³个。这些限制性条件决定了此类方法只适于一些已经建成细胞系，无法推广到真正的临床实际工作中去。

3)基因组文库方法不仅需要获得已建成的肿瘤细胞系，还要耗费大量劳动力去对得到的文库克隆进行大规模筛选和测序鉴定。所以，这类方法除了能够提供最为直接和可靠的病毒整合证据之外，就几乎不再具有任何其他实际的临床应用价值了。