[发明专利]一种提取禽类全血DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取禽类全血DNA的方法。

背景技术

基因组DNA包含了细胞中全部的遗传信息，在分子实验中的PCR检测试验和HLA基因分型中，模板基因组DNA制备的质量是实验成功与否的关键。禽类血液基因组DNA提取的方法较多，选择简易、快速、价格低廉、纯度好、得率高的方法是提取基因组DNA的重要条件。而目前使用的DNA提取方法提取时间都较长，在分子实验室中常用的DNA提取方法是“酚-氯仿”法。

“酚-氯仿”法具体步骤如下：

试验前先对所用器具，试剂，耗材进行高压灭菌。

①冻血液在室温融化以后，取50μL移至离心管中，加入500μLSTE缓冲液，10μL SDS，加入10μL蛋白酶K(浓度为10μg/μL)，混合，上下充分摇动，37℃摇床水浴2小时，然后55℃水浴过夜。

②将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，轻摇离心管20分钟，直至两相混合形成乳浊液，4℃，12000r/min离心10分钟。

③取上清，再加入等体积苯酚，轻摇离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

④取上清，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇混合液(24∶23∶1)，缓慢颠倒离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

⑤取上清，加入等体积氯仿，缓慢颠倒离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

⑥取上清，加入2倍体积的预冷-20℃冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色DNA沉淀。

⑦4℃，12000r/min离心10分钟，去上清，然后加4℃预冷的70％乙醇快速冲洗两次，12000r/min离心10分钟，去上清。

⑧将DNA置于室温下自然风干干燥(注意不能太干燥)，根据沉淀的量加入适量(100-200μL)TE(pH8.0)缓冲液溶解，置4℃冰箱溶解过夜；溶解后的DNA可贮于4℃、-20℃、-70℃中备用。

注意在抽吸上清液时，尽量小心勿将中间的蛋白质层抽出。

在这种常规提取DNA的方法的缺点：

1、第②③④部均要涉及到苯酚的使用。苯酚属于剧毒物品，可经呼吸道、皮肤和消化道吸收。

苯酚的毒理学：

低浓度酚能使蛋白变性，高浓度能使蛋白沉淀。对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，也可抑制中枢神经系统或损害肝、肾功。

水溶液比纯酚易经皮肤吸收，而乳剂更易吸收。吸入的酚大部分滞留在肺内，停止接触很快排出体外。吸收的酚大部分以原形或与硫酸、葡萄糖醛酸或其他酸结合随尿排出，一部分经氧化变为邻苯二酚和对苯二酚随尿排出，使尿呈棕黑色(酚尿)。

人口服致死量报道不一，LD为2～15g，或MLD为140mg/kg，14g/kg。国外报道酚液污染皮肤面积为25％，10分钟死亡，血酚为0.74mmlo/L。

2、提取时间较长：

在这个方法中第一步中需要37℃摇床水浴2小时，然后55℃水浴过夜，这个步骤需要耗时至少12小时，这样使DNA提取的时间变成。

在公开号为CN 101215558A专利中公布了一种全血DNA的提取方法。该方法在提取第一步时要需要置于50℃水浴20～28小时，同时也涉及到加入苯酚，而且需要加入100μL抗凝血。

在实际操作过程中，有血液样本资源十分宝贵，来源有限，不可再生，丢失会造成无法估计的损失，其后果无法挽回。

因此，需要一种高效、快速、安全的DNA提取方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效、快速、安全的提取禽类全血DNA的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种提取禽类全血DNA的方法，包括下述步骤：1)冷冻血液在室温融化以后，取血液22μl加入离心管，再加入缓冲液860μl、裂解液100μl、蛋白酶K 15μl，总体积不超过1000μl；漩涡振荡5分钟，使其完全混匀；2)56℃金属浴或水浴消化至少3小时；3)加入预冷的氯仿500μl，旋转混合5分钟，使其完全混匀；4)13000r/min离心5分钟，吸取上层水相；5)在上清液中加入等体积预冷的的异丙醇，缓慢摇动离心管5分钟；6)13000r/min离心5分钟，使DNA贴到离心管壁上，弃上清液；7)用预冷的70％乙醇洗涤沉淀物2次，每次洗涤后，13000r/min离心8分钟，弃上清液；8)于真空干燥器中或45℃烘箱中干燥DNA沉淀物，待团块透明后，视沉淀大小，加入100～200μl TE溶液充分溶解DNA，-20℃冰箱中保存。