[发明专利]一种Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白的制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术药物和生物治疗学领域，涉及免疫靶向治疗疫苗载体的构建以及载体和短肽耦联的方法。

背景技术

针对慢性疾病的治疗性疫苗是目前疫苗研究的热点，这些疾病包括：慢性病毒感染、过敏性疾病、肿瘤、糖尿病、高血压和阿尔采默病等，其中一些治疗性疫苗在临床试验中有较好的效果，具有广阔的应用前景。与普通预防性疫苗不同的是：治疗性疫苗针对的是自身抗原或外来免疫耐受抗原，因此，治疗性疫苗要发挥治疗作用必须首先打破免疫耐受，产生针对特定抗原的自身抗体或自身反应T细胞。由于治疗性疫苗所针对的靶抗原一般是短肽，抗原性较弱，必须与合适的载体结合后，在免疫佐剂的帮助下才能发挥作用，因此，选择合适的载体及佐剂往往是治疗性疫苗成功的关键。

在该发明提出之前，过去常用的载体如KLH、破伤风类毒素等，效力一般不强，必须使用佐剂，而常用的佐剂如弗氏佐剂虽然有效诱导机体免疫反应，但不能应用于人体，铝制佐剂虽然可应用于人体，但存在其他副反应如脑动脉硬化等。因此，理想的治疗性疫苗载体，应该在与靶抗原结合后，在不应用免疫佐剂的情况下，产生抗体或自身反应T细胞，从而发挥 治疗作用。病毒样颗粒就是这样一类理想的疫苗载体。

病毒样颗粒(VLP)是由病毒的衣壳蛋白装配成的不含病毒核酸的空壳结构，具有病毒的外形和免疫原性，可通过和病毒感染一样的途径诱导机体产生以体液免疫为主的反应，从而诱导产生针对与之结合的抗原的抗体，但不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒感染的风险。由于病毒较细菌更原始，与哺乳动物的种属差异更大，作为载体其免疫原性极强(如强于破伤风类毒素等)。此外病毒样颗粒由大量重复结构的衣壳蛋白单体聚合而成，进入体内后可以将特异性B细胞表面大量B细胞受体(BCR)聚集到一起，提供足够强的第一信号活化B细胞，从而有利于突破自身免疫耐受。每个衣壳蛋白单体一般具有碱性氨基酸(如赖氨酸)，有些碱性氨基酸侧链的氨基(-NH₂)朝向颗粒的外表面，短肽等大分子只要带有合适的氨基酸(如-SH)，通过异双功能交连剂(如Sulfo-SMCC)就能结合于VLP表面，刺激机体产生抗体。已有基于VLP的血管紧张素II疫苗成功进行II期临床试验，具有良好的降压效果。

制备用于治疗性疫苗载体的病毒样颗粒，选择合适的病毒十分重要。虽然病毒样颗粒本身不具有感染性，但是能感染人体的病毒可能与人体组织存在交叉反应，免疫后可能产生心肌炎等自身免疫性疾病，并且如果机体已感染过该病毒，该载体的免疫作用将减弱，从而不能发挥治疗作用。因此选择合适的源病毒是关键，噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在，包括人体排泄物，它只寄居在易感宿主菌体内，对人体无害。目 前国内外已制备出MS2噬菌体病毒样颗粒，国外也有Q β噬菌体病毒样颗粒用于降压疫苗的II a临床试验，这两种噬菌体及F2噬菌体均属单链线形RNA病毒，其外形成球形，由其衣壳蛋白组成的病毒样颗粒非常适合用作治疗性疫苗的载体。

发明内容

本发明目的是构建一种病毒样颗粒，并对其进行改建，使其成为免疫靶向治疗的短肽载体，能够诱导机体产生高滴度特异性抗体，从而为免疫靶向治疗提供平台。

为了实现本发明的目的，本发明设计人员充分考虑研究了Qβ噬菌体的生物特征，因为Q β噬菌体属于III类RNA噬菌体，表面结构和I、II类噬菌体相似，编码衣壳蛋白的C基因由两部分组成，CP蛋白基因，以及CP延伸蛋白基因，CP蛋白基因末端为第一个终止密码子TGA，噬菌体有时会错读终止密码子而继续表达，从而生成CP延伸蛋白，从而得到C基因表达产物-A1蛋白(如图1)。CP延伸蛋白第72位至73位氨基酸所在位置是病毒刺突顶端免疫优势决定区，在CP蛋白辅助下，A1蛋白可以自行聚合为病毒样颗粒。这为本发明的实现奠定了良好的基础和平台。

本发明所提供的病毒样颗粒蛋白Qβ-2aa，按下述方法得到：

步骤1)将Qβ噬菌体CP蛋白基因终止密码子，突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQβ-CP；

步骤2)在Qβ噬菌体CP延伸蛋白免疫优势决定区对应基因内插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸(AAGCTT)，并将CP蛋白基因终止密码子TGA(CP蛋白基因第135位密码子)突变为GGA后，克隆至原核表达载体PGEX4T-2 中，得到编码A1蛋白质粒PGEXQβ-A1；