[发明专利]旋毛虫病斑点免疫金渗滤法诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术，尤其是涉及一种以旋毛虫Ts21重组抗原检测血清中抗旋毛虫抗体的斑点免疫金渗滤法诊断试剂盒。

背景技术

旋毛虫病是一种严重的人兽共患疾病，主要因生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉或其它动物肉类而感染，本病不仅对人类的健康构成严重威胁，而且给养猪业和肉类进出口贸易造成巨大经济损失。

目前旋毛虫病的临床确诊主要靠肌肉活检，但轻度和早期感染者往往不易检出，即使晚期患者因取材局限活检阳性率也只有50％左右，且不易被患者接受；国内外学者对旋毛虫病的血清学诊断方法进行了大量研究，如间接荧光抗体试验(IFAT)、免疫酶染色试验(IEST)、酶联免疫印渍技术(ELIB)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等，但这些方法操作较复杂，常需2～3h才能得出检测结果；此外，由于所用的诊断抗原多为旋毛虫肌幼虫虫体抗原，因抗原成份较复杂，与其它寄生虫病患者血清常有交叉反应出现假阳性，且均存在成本高、操作繁琐、需要特殊仪器与专业检测人员等问题，这些问题都使其推广应用受到限制。因此，寻找适合旋毛虫病的快速诊断方法是当前旋毛虫病防治工作中亟待解决的问题之一。

胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点，近年来已在各种生物学研究中广泛使用，在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，金标过程中无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附，因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变，使用时不受组织、细胞中内源性酶的影响，结果可以长期保存，实验结果表明，胶体金的敏感性可达到ELISA的检测水平。免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。

基于胶体金标记技术的斑点免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay，DIGFA)是近年来建立的用于检测各种病毒、细菌、寄生虫病及自身免疫病的新方法，其基本原理仍是间接法或夹心法(间接法测抗体：固定于膜上的特异性抗原+标本中的相应抗体+金标记的抗体或金黄色葡萄蛋白A(SPA)显色；夹心法测抗原：固定于膜上的多克隆抗体+标本中待测抗原+金标记的特异性单克隆抗体显色)，斑点免疫金渗滤法检测速度快，结果观察一目了然，具有制作方便、价格低廉、容易操作、无放射性污染等优点，但目前尚未将此方法用于检测旋毛虫病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可广泛应用于人和动物特异性快速诊断的旋毛虫病斑点免疫金渗滤法诊断试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的旋毛虫病斑点免疫金渗滤法诊断试剂盒，它包括下述制备步骤：

第一步：制备Ts21重组蛋白

根据GenBank核酸数据库中Trichinella spiralis Hypothetical ORF17.20的基因序列，利用生物信息学软件Primer5.0设计引物，通过RT-PCR获取旋毛虫Ts-21基因，构建表达载体pAML-c2X-Ts21，转化大肠埃希菌TB1，获得阳性克隆pAML-c2X-Ts21/TB1；挑取pAML-c2X-Ts21/TB1单菌落至5mL含氨苄青霉素100μg/mL LB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀≌0.6，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.25mmol/L，37℃诱导培养4小时，离心收集菌体，超声破碎菌体，4℃，4320g离心10分钟后收集上清液；经Amylose树脂预装柱亲和层析纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定，得到纯化的Ts21重组蛋白；测定蛋白浓度、分装，-80℃保存备用；

第二步：制备胶体金标记物

采用枸橼酸三钠还原氯金酸法制备颗粒直径为15nm的胶体金溶液；调节胶体金溶液pH至5.8～6.0后过滤；将浓度为1mg/ml的待标记蛋白质溶液缓慢搅拌并分次加入胶体金溶液中，混合均匀，加1％聚乙二醇，使其终浓度为0.05％，然后离心纯化，得10％浓缩的胶体金标记物，4℃保存备用；

第三步：制备试剂盒