[发明专利]检测重金属胁迫下核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法

权利要求书

1.一种快速检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其特 征在于，按如下的步骤进行：

(1)切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h；经 PBS缓冲液洗；

(2)采用2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶酶液于37℃温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤 后压片；

(3)将植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态， 用滴管吸取约0.1-0.2ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干 后备用；

(4)将(3)得到的载玻片放在1％TritonX-100浸泡15-20分钟；经PBS缓冲液洗涤；

(5)在(4)得到的载片上滴入15-20μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1 h-1.5h；再经PBS缓冲液洗涤；

(6)再将(5)得到的载片上滴入15-20μl配好的二抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育 45min-1h；经PBS缓冲液洗涤；

(7)再将(6)的载玻片上滴加15-20μl DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤；

(8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5-10μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片， 用指甲油将盖玻片四周封好，1-2h后在荧光显微镜下观察。

2.权利要求1所述的检测方法，其中步骤(2)中酶解所用时间是指：在镜检时 如果观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经 解体，只剩下细胞核时，即结束酶解。

3.权利要求1所述的检测方法，其中步骤(2)中所述的压片是指：酶解后直接将 样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻片上，不盖盖玻片，自然风干后备用。

4.权利要求1所述的检测方法，其中所述的PBS缓冲液洗是指采用PBS缓冲液 洗3次，每次10-15分钟。

5.权利要求1所述的检测方法，其中的一抗为：鼠抗核仁纤维单克隆抗体，其浓 度为0.5mg/ml。

6.权利要求1所述的检测方法，其中的二抗为：FITC-兔抗鼠IgG其浓度为 0.75mg/ml。

7.权利要求1所述的检测方法，其中DAPI的浓度为1μg/ml。

8.权利要求1所述的检测方法，其中的防淬灭剂为10×1ml。

9.权利要求1所述的检测方法，其中的重金属为Cd、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、 Pb、Co、Ag或Zn。

10.权利要求1所述的检测方法，其中所述的植物包括蚕豆、洋葱、向日葵或玉米。