[发明专利]检测重金属胁迫下核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种快速检测重金属胁迫下核仁蛋白质变 化的定位方法。更具体的说是一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫 荧光方法。该方法为研究重金属毒害植物细胞机理提供新的技术支持。

技术背景

随着矿产资源的大量开发，农药、化肥的广泛使用以及城市污泥、污水的农用， 重金属对土壤、水体的污染越来越严重。过量重金属(Cd、Cr、Hg、Pb、Cu、Zn、Ag、 Sn等)进入环境，参与水体-土壤-生物系统的循环，通过植物的吸收在植物体内大 量积累，经食物链危及动物和人类健康。目前，全球性的重金属污染状况日益严重，如 何控制和减轻重金属对环境的污染和危害，已成为科学家们关注的热点课题。大量研究 表明了过量重金属对植物产生毒害作用，影响植物正常生长发育；引起植物生理、生化 的变化；诱导染色体畸变；损伤细胞结构。

核仁(nucleolus)是细胞核中一种明显的功能区域。核糖体形成的大多数步骤发生 在核仁中，包括核糖体基因的转录、核糖体RNA前体的加工和rRNA与核糖体蛋白及5S rRNA的联系等一系列复杂的过程。核仁的功能不仅限于核糖体合成，它还具有其它重 要功能，包括几种小RNA的核苷酸的修饰、信号识别颗粒的生物合成，与基因沉默、 衰老和细胞分裂有关蛋白的时期性的封存和释放等。因此，核仁结构的损伤势必影响其 功能的正常发挥，从而造成细胞多种生命活动的严重障碍。核仁的化学成分主要由 DNA、RNA、蛋白质和酶类等组成，其中以蛋白质为主。利用蛋白质组学方法已鉴定 了350中核仁蛋白，这些蛋白质与核仁的功能密切相关。

人们利用分子生物学和细胞生物学手段，从不同角度研究重金属对核仁的结构以及 核仁蛋白质分布及功能的影响。硝酸银染色就是用于研究重金属对核仁结构损伤的一种 常用技术，其主要机制是硝酸银能将核仁中酸性非组蛋白染色。发明人利用此技术研究 了不同重金属(Cd、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Zn、Al)胁迫对蚕豆、向日葵、 洋葱及玉米等植物幼苗根尖细胞核仁的影响，这些研究结果表明：重金属胁迫能够损伤 核仁结构，导致核仁中银染蛋白物质外溢到细胞质中。因此，利用银染技术研究重金属 对植物细胞核仁结构的影响，具有一定的科学价值。但是，银染技术只能鉴定重金属胁 迫后，从细胞核外溢到细胞质中的银染颗粒是核仁蛋白，至于究竟哪些核仁蛋白受到重 金属胁迫的影响不能具体鉴定，具有一定的局限性。

近年来，免疫荧光技术得到了飞速发展，作为一种研究方法或实验手段，已被广泛 地应用于生命科学领域和医学科学领域内，诸如：测定生长因子、蛋白质定位、核酸分 析、神经递质研究等。

核仁纤维蛋白是真核细胞内重要的核仁蛋白之一，在进化上具有高度保守性。在 间期细胞内，核仁纤维蛋白定位于核仁的纤维中心(FC)和致密纤维组分(DFC)区域。它 主要参与了核仁在细胞周期中的解体和重建过程，其中包括rRNA的合成加工修饰以及 核糖体的组装等。此外，核仁纤维蛋白还是构成核仁骨架的主要蛋白成分之一。但是， 利用免疫荧光技术研究重金属胁迫对核仁纤维蛋白的功能和动态变化的影响尚未见文 献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧 光方法，为研究逆境胁迫下细胞中蛋白质定位及变化特征提供了简易、准确、快速的方 法。

本发明人结合实验室前期工作，发明了一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋 白定位的免疫荧光方法。该技术的主要原理是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光 标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可 在荧光显微镜下检出，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 特别是本发明涉及的压片方法的改革，能够提高观察细胞数目，可适用于其它细胞生物 学研究。为达到上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种快速检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其特征在 于，按如下的步骤进行：

(1)切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h；经 PBS缓冲液洗；

(2)采用2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶酶液于37℃温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤 后压片；