[发明专利]一种微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制备D-胱氨酸和L-色氨酸的方法

说明书

【技术领域】：

本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过微生物酶法拆分DL-半胱氨酸生产D-胱氨酸和L-色氨酸的方法。

【背景技术】：

胱氨酸是重要医药中间体，也常用于制备复方氨基酸口服制剂或输液、染化剂、化妆品、乳制品添加剂、油脂抗氧剂等；还可用于重金属解毒剂、肝炎等药物。胱氨酸具有促进机体细胞氧化还原能力，增强白血球以防止病原菌感染，可用于治疗白血球减少症、冠心病，防治脂肪肝、肝硬化，促毛发生长、防皮肤老化，也可用于伤寒痢疾、流感、气喘、神经痛、湿疹及各种中毒等疾患的治疗。

D-胱氨酸为D-半胱氨酸的二聚体，通过还原手段可以有效获得重要的药物中间体D-半胱氨酸。D-半胱氨酸是一种非天然氨基酸，可广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料等行业，是手性药物的重要中间体，如D-半胱氨酸是合成第三代头孢菌素——头孢米诺钠的重要原料，在7β位侧链末端引入了D-半胱氨酸，具有很强的杀菌作用，可以用于治疗呼吸道感染；由D-半胱氨酸衍生得到的D-青霉胺可作为解毒药，用于重金属的拮抗剂，也用于类风湿性关节炎及慢性活动性肝炎等免疫性疾病；另外，2-(2，4-二酚羟基)-4，5-二氢噻唑-4(S)-羧酸、N-乙酰-D-半胱氨酸、FK-228、N-(S)-3-烷基庚酰基-D-R-谷氨酰基-甘氨酰基-D-丙氨酸和阿奇霉素等系列药物均以D-半胱氨酸为原料药物。除此之外，D-半胱氨酸盐还是大肠杆菌的强抑制剂，也可作为急性酒精中毒的缓解剂，同时也是一些蛋白酶的抑制剂，在炎症以及HIV治疗等方面也具有一定疗效，因此用途十分广泛。

D-半胱氨酸盐酸盐的制备工艺比较复杂，通常采用不对称合成方法制备，反应步骤多，生产控制难度大，需要使用价值昂贵的手性试剂；而酶法拆分反应条件温和，选择性强，副反应少，收率高，光学纯度高，是D-半胱氨酸的生产的有效方法。

L-色氨酸是人和动物体内的重要必需氨基酸，在医药、食品和饲料等领域均具有非常广泛的用途。近年来，由于饲料工业发展迅速，以及L-色氨酸在医药行业的用途不断扩大，国内外对于L-色氨酸的需求量日益增加。但由于长期以来L-色氨酸的生产难度高、价格昂贵，除医药用途外，L-色氨酸在其它领域均未能大量推广应用。

L-色氨酸的生产方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶法合成法四种。其中，酶法合成法利用化学合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易等优点。酶法合成L-色氨酸的途径主要涉及色氨酸合成酶(EC 4.2.1.20)和色氨酸酶(EC 4.1.99.1)，二者均可催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸。由于吲哚对色氨酸合成酶具有强烈的抑制作用，而色氨酸酶对吲哚则具有良好的稳定性，所以近年来人们更为关注色氨酸酶在L-色氨酸生物合成中的应用。

色氨酸酶正常情况下分解L-色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨，但在高浓度丙酮酸和氨的条件下也能有效的催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸。该酶还能催化L-丝氨酸或L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸。色氨酸酶催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸的途径中，由于底物吲哚对色氨酸酶抑制作用较弱，且丙酮酸价格不高，因而具有一定的实用性，但该途径是色氨酸水解的逆反应，要求底物浓度较高，反应平衡不易把握。而以L-丝氨酸和吲哚为原料合成L-色氨酸的途径中，由于底物L-丝氨酸的价格几乎与L-色氨酸相当，因此实用性不强。因此利用色氨酸酶催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸的途径中，由于底物L-半胱氨酸的生产成本较为低廉，因此该途径具有重要的工业化应用价值。

目前DL-半胱氨酸拆分主要是采用化学方法，化学拆分法是使外消旋体与手性试剂作用生成非对映体，利用非对映体物理、化学性质的差异而将它们分开。以DL-半胱氨酸为原料，分别采用路线如下：(1)以L-酒石酸为拆分剂，经由2，2-二甲基四氢噻唑-4-羧酸不对称转化，生成D-2，2-二甲基四氢噻唑-4-羧酸-L-酒石酸盐，使其在水溶液中水解，得到D-半胱氨酸。(2)以DL-半胱氨酸为原料，先制备D-4-四氢噻唑-4-羧酸，然后再使其和羟胺反应得到半胱氨酸，之后利用优先结晶的方法得到旋光异构体。(3)以L-噻唑啉羧酸为拆分剂，生成DL-半胱氨酸-噻唑啉羧酸盐，利用优先结晶的方法得到D-、L-半胱氨酸-噻唑啉羧酸盐，之后采用三乙胺处理可得到光学纯度的D-和L-半胱氨酸。而化学拆分方法具有步骤长，收率低，不利于环保的特点。