[发明专利]一种重组腺病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组腺病毒，具体是一种含有东亚钳蝎氯离子通道毒素(简称BmK CT)基因的重组腺病毒及其制备方法以及该重组腺病毒在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。

背景技术

脑神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的一种恶性肿瘤，常规的临床治疗主要以外科手术切除，放疗或者化疗为主，不能彻底治疗并且容易复发，治疗过程中对患者自身也有很大的损伤。随着基因操作技术的发展，基因治疗得到了广泛的应用。腺病毒载体携带特定抑癌基因在癌症治疗方面有很明显的优势。腺病毒最早在人体内发现，可以感染大多数的哺乳动物细胞并且稳定表达目的蛋白，在正常的组织中通过免疫反应可以消除，而且腺病毒基因组不会整合到宿主细胞的基因组中，E1/E3区缺失的复制缺陷型病毒在哺乳动物细胞内不能正常复制且不会产生致病蛋白，提高了腺病毒载体在基因治疗中的安全性。

东亚钳蝎氯离子通道毒素(BmK CT)由35个氨基酸组成，含4对二硫键，与从以色列蝎L.quinquestriatus中提取的小电导氯离子通道抑制剂蛋白的同源性在60％以上。本课题组前期的研究表明，大肠杆菌表达和纯化的BmK CT蛋白可以通过抑制胶质瘤细胞上的基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的表达，从而抑制了肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)的黏附和降解，降低了肿瘤细胞的迁移能力。

如何使优化后的BmK CT基因导入靶细胞内并使其高效稳定表达是BmK CT用于神经胶质瘤治疗所面临的关键环节。腺病毒载体是目前研究和临床中使用最广泛的具有高效感染率和表达的基因表达载体，可在包装细胞中获得较高的病毒滴度，能感染分裂期和非分裂期的细胞。并且，腺病毒载体因为其具有转移效率高、感染细胞谱广、病毒滴度高和安全的优点，是基因疫苗、基因治疗、组织工程等研究中重要的转基因病毒载体。因此，将优化后的BmKCT基因整合到腺病毒基因组上包装纯化重组腺病毒是解决该问题的有效途径。

目前，国内外已经有关于腺病毒载体连接特定基因在神经胶质瘤，恶性肿瘤，前列腺癌，肝癌，食管癌等的报道，但尚未发现有重组腺病毒介导的蝎氯离子通道毒素基因治疗神经胶质瘤的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有BmK CT基因的重组腺病毒；提供一种构建该重组腺病毒的方法；以及该重组腺病毒在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。

本发明提供的一种重组腺病毒，AdEasy-1-BmK CT，已于2009年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.3499。

该腺病毒可以在被感染的宿主细胞内表达绿色荧光蛋白、东亚钳蝎氯离子通道毒素，且其基因组缺失E1/E3区，不会整合到宿主细胞的基因组中。

本发明提供的一种重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用偏爱密码子表合成能在哺乳动物细胞中高效表达的东亚钳蝎氯离子通道毒素(BmK CT)基因，原始BmK CT基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，优化后的BmK CT基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2；合成特异性引物：

上游：5’-tt gat atc atg tgc ggc ccc tgc ttc-3’(见SEQ ID No.3)

下游：5’-at ctc gag tca gat acg gtt gca cag gc-3’(见SEQ ID No.4)

经PCR扩增获得蝎氯离子通道毒素基因，且分别在5’端和3’端加上Xho I和Hind III酶切位点并连接到中间载体pShuttle-IRES-hrGFP-2中获得重组质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmKCT；

(2)将重组质粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT用Pme I酶切线性化后转化含有腺病毒基因组pAdEasy-1的BJ5183细菌中发生同源重组，筛选出重组腺病毒基因组pAdEasy-1-BmKCT后转化到XL10 Gold细菌中大量复制，将重组的腺病毒基因组酶切线性化后转染AD293细胞，包装复制后获得重组腺病毒AdEasy-1-BmK CT；