[发明专利]Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法

权利要求书

1.一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法，包括基因组DNA提取、引物设计、PCR扩增、电泳检测步骤，其特征在于本方法的具体步骤如下：

(1)使用常规酚/氯仿法从临床样本中提取基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应引物为：

PCR反应体系：总体系为20μL，包含50ng基因组DNA，PH为8.3的10mMTris-HCl，1.5mM MgCl₂，50mM KCl，0.5U TaKaRa rTaq，175μM dNTP，突变特异引物L3179和H3635各0.15μM，内参引物L1156和H1782各0.075μM；

PCR反应程序：94℃，预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸7min；

(3)PCR产物检测：取PCR产物2μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压电泳30min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照；

(4)灵敏度检测：

能检到的最低水平的突变DNA的浓度：以1ng、2.5ng、5ng、10ng的含有G3635A突变的DNA为模板，用与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测；

能检到的最低水平的突变异质性：将正常人DNA样本与含有G3635A突变的患者DNA样本在总量为50ng的情况下按设定比例混合，使突变的DNA样本比例分别为5％、10％、15％和20％，将混合好的DNA模板按照与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。