[发明专利]Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法，属Leber遗传性视神经病变研究技术领域。

背景技术：

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON；MIM 535000)是由线粒体DNA突变所导致的致盲性母系遗传性疾病，主要多发于青壮年男性，并且存在疾病不完全外显现象，即含有线粒体DNA原发突变的个体也不一定会临床发病。基于欧洲西部人群的调查研究发现，每25,000-50,000人中就有一例LHON患者；亚洲人群中目前还没有相关的临床调查资料。

前人研究表明，95％以上的LHON是由线粒体DNA的三个点突变G11778A、G3460A、T14484C中的一种引起的。基于这三个原发突变的基因检测是目前临床上对该病确诊的一种重要的手段。欧亚病人群体中，这三种原发突变的分布情况差别很大，提示原发突变谱在欧亚人群中迥异。针对临床上大量的疑似LHON病例的研究，有望拓展国人LHON原发突变的名录，为临床遗传诊断和咨询服务。Jia等人2006年对国人群体中903个有LHON临床症状的患者检测发现，有557个患者没有检测到上述三个原发突变中的任何一个，提示国人群体中存在新的有待证实和发现的线粒体DNA原发突变。Brown等人2001年在一个不含有三个主要的原发突变的俄罗斯LHON家系中发现，线粒体DNA突变G3635A是其发病的原因。该突变导致线粒体呼吸链复合物I NADH脱氢酶ND1亚基第110位高度保守的丝氨酸转变成天冬酰胺，从而使呼吸链功能受损。G3635A突变被首次报道后，一直未见相关的后续研究和报道来证实该突变的致病性。近期，我们在一个有LHON临床症状却没有携带三个原发突变的国人家系中也检测到G3635A突变，二级结构预测分析显示该突变减弱了ND1蛋白的疏水性，这种结构上的改变或许会进而引发LHON。Yang等人几乎同时在另外两个疑似LHON但无三个原发突变的国人家系中也发现了G3635A突变。我们未发表数据显示，G3635A突变在表现LHON临床症状的国入患者群体中出现的频率达到1％。这些研究证实了G3635A是国人群体中LHON发病的一个重要的致病性突变。

目前，对于LHON尚无有效的治疗方法。以分子遗传学检测方法对该病进行遗传研究在一定程度上能预防该病的发生。因此，对于基因检测未发现有G11778A、G3460A、T14484C三个主要原发突变的LHON患者家系进行G3635A突变检测，无疑对于该病的遗传研究、遗传咨询和预防具有重要的意义。

目前公开的与本发明相似的检测线粒体DNA突变G3635A的申请专利有一个，其名称为“Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用”，申请号200810204771.7，该发明所用方法为基因芯片技术，该方法对仪器设备的要求很高，且成本较高，不适合在常规的实验室推广使用。

现有很多其他检测DNA突变的技术，如单链构象多态性分析(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、等位基因特异PCR等。其中，等位基因特异PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)由于其经济、快速、简易的特点被广泛应用到各种DNA突变检测工作中。等位基因特异PCR的原理是将引物3′末端设计成突变特异的碱基，配合适当的反向引物，有突变的DNA因3′末端与引物配对从而扩增得到突变特异的PCR产物，而无突变的DNA模板不能与突变特异性引物配对，从而不能扩增得到PCR产物。通过常规的琼脂糖电泳检测PCR产物的有无，进而来判断检测样本DNA是否存在突变。

经文献检索，未见与本发明方法相同的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种快速、简易、经济的Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法。