[发明专利]一种以叶绿素酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法

权利要求书

1.一种制备以叶绿素酶作为烟草加工辅助的酶制剂的方法，其特征是：

（1）以烟草顶杈叶作为提取叶绿素酶的原料，抽样检测叶绿素酶酶活力，合并酶活力相近的顶杈叶；

（2）用pH8.0缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂，使其浓度为0.01mol/L后加入顶杈叶，顶杈叶与含有PMSF的缓冲液的比为1g︰4mL，打碎匀浆，过滤，收集滤液，以顶杈叶质量与PMSF的缓冲液体积比1g︰5mL，再次向滤渣加入缓冲液，搅拌2h，过滤挤渣，滤液与前次滤液合并，静置1h；

（3）静置液以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使硫酸铵终浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h后补加(NH₄)₂SO₄使终浓度为80%，过夜，在4℃ 15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度为10%W/V的(NH₄)₂SO₄过夜，在4℃ 15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；

（4）将沉淀用初始缓冲液总量的一半充分溶解后，用0.1% EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心；

（5）将步骤（4）离心获得的上清液中加入浓度0.01%的蔗糖低聚物，上清液与蔗糖低聚物体积比为100︰1，经-8℃冷冻干燥浓缩8～10倍得浓缩酶制剂，检测酶活力，用多批次酶制剂相互兑配，调整制剂酶活力为250～450U/mL。

2、根据权利要求1所述的制备以叶绿素酶作为烟草加工辅助的酶制剂的方法，其特征是调整步骤（5）中所述制剂的酶活力为370U/mL。

3、使用如权利要求1所制备的叶绿素酶作为烟草加工辅助的酶制剂的方法，其特征是稀释叶绿素酶制剂250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其酶活力范围为1～1.8U/mL。

4、根据权利要求3所述的使用酶制剂的方法，其特征是稀释叶绿素酶制剂作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其酶活力为1.46U/mL。