[发明专利]一种以叶绿素酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草复烤前添加的提高烟草品级的多酶复合制剂及制备和使用方法。 

背景技术

叶绿素酶(E.C.3.1.1.14)是植物生理重要的生理性功能酶，作为地球上最重要的光合色素，叶绿素降解与农作物衰老、果实成熟和树木落叶等植物生理现象密切相关。自1912年报道叶绿素酶后，在高等植物叶片及藻类中叶绿素酶及绿素酶与叶绿素降解之间关系广泛得以研究。通过30％、35％丙酮和60％、75％硫酸铵沉淀组分可得较高叶绿素酶活性；经40％～60％硫酸铵沉淀、透析、葡聚糖G-100凝胶过滤等处理后可得纯化86倍的叶绿素酶。近年来的研究确定了叶绿素酶是叶绿素降解中的关键酶，克隆出的叶绿素酶基因共有4种并且均在大肠杆菌中表达成功，分别是黎叶绿素酶CaCLH、柑桔叶绿素酶CHLASE1和拟南芥叶绿素酶AtCLH1、AtCLH2。叶绿素酶在植物和藻类中有着广泛的分布，分子量从27～65不等，这种差异来源于植物种类的不同或同功酶的存在。至少有一种叶绿素酶存在于质体中。CaCLH和AtCLH1存在于细胞器而非叶绿体中。植物衰老促进剂甲基茉莉酸(methyl jasmonate)可增加AtCLH1 mRNA的浓度，以及相应蛋白质含量和叶绿素酶活力[唐蕾。叶绿素酶研究的新进展。生命的化学，2002，22(4)：373～374]。作为植物生理涉及的酶，关日强等研究了二氯苯醚菊酯对黄瓜光合色素及有关酶活性的影响。用二氯苯醚菊酯(PER)处理黄瓜幼苗48h，叶绿素酶活性比对照升高4.72％～22.61％，叶绿素总量比对照下降5.55％～46.43％，PER处理6d后的类胡萝卜素含量分别下降36.47％[关日强，等。二氯苯醚菊酯对黄瓜光合色素及有关酶活性的影响。华南农业大学学报2001，22(2)：52～55]。在烟草质量的诸多研究中，高春亮等认为质体色素和多酚的降解使烟叶外观质量明显改善，这是由于多酚作为一种深棕色色素，能够在多酚氧化酶的作用下降解生成一种铁-蛋白质-绿原酸芸香苷复合物，多酚的降解促使叶色由陈化前的浅黄、正黄色向金黄、深黄及棕黄色转变；质体色素的降解导致烟叶颜色变浅，色泽均匀[高春亮等  陈化期间空气湿度对山东和贵州烟片质量的影响  中国烟草科学，2008，29(5)：32～36]。 

在叶绿素含量及酶的测定上，由于叶绿素在不同溶剂中的吸收谱有差异，用不同溶剂提取色素，测定计算公式也有所不同。叶绿素a、b在95％乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm[李合生，等。植物生理生化实验原理和技术。北京：高等教育出版社，2000，p130～137]。植物叶绿素含量测定大致可分为分光光度计和活体叶绿素仪两大类，第一类，分光光度计法包括：①国际上被广泛应用，作为Arnon法的丙酮法。有提取量大、叶绿素易受光氧化破坏大量样品不适宜等麻烦；②在丙酮法的基础上形成的更为麻烦的乙醚法(也叫Smith-Benitoz法)；③二甲基亚砜法和④二甲基甲酰胺法；还有⑤无水 乙醇法，⑥丙酮乙醇混合法及⑦丙酮无水乙醇等量混合而成提取液，直接浸泡提取叶绿素的丙酮乙醇混合液法，此法1985年由张宪政提出，比丙酮乙醇水混合液法、二甲基亚砜法的叶绿素提取液稳定，不易受光氧化破坏，按丙酮法的公式计算叶绿素含量。第二类主要用于活体叶绿素测定的有⑧透射型活体叶绿素仪法，在670～675nm波长的光有一吸收高峰，其吸收值与叶绿素含量成正相关。因植物不同活体叶片吸光系数不同，需经校正仪器才可对生长状态的叶片进行非破坏性快速测定；⑨反射型活体叶绿素仪，是80代后发展的主要以800nm和550nm两波长光反射率的比(ρ801/ρ550，x或y)对单位叶面积的叶绿素含量(μg/cm，y或x)，研究y＝ax+b及相关性[苏正淑，等。几种测定植物叶绿素含量的方法比较。植物生理学通讯，1989，(5)：77～78]。 

对于植物叶绿素含量的测定中多以分光光度计的丙酮乙醇混合法，不同样品丙酮和乙醇混合比有所不同。对叶绿素酶是将样品研磨后，用丙酮多次洗脱尽量除去叶绿素的方法进行叶绿素酶的活性测定：取一定量的植物组织样品研磨后，用丙酮多次洗脱除去叶绿素，室温干燥粉碎。加入2mL底物和1mL磷酸缓冲液(pH8.0)于25℃下保温12h，立即加入3mL石油醚，充分振荡后3500r/min离心15min。计量上清液的体积，并取上清液体在667nm下测定吸光度。整个测定过程在黑暗中进行[郁志芳，等。鲜切芦蒿贮藏过程中叶绿素、纤维素及相关酶的变化。中国野生植物资源，2003，22(4)：61～64；甘志军，等。小麦叶绿素酶生化动力学特性研究。西北植物学报，2003，23(5)：750～754]。