[发明专利]一种高效生产纤维素酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程及生物化工技术领域，尤其涉及一种高效 生产纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素是世界上最丰富的可再生资源，利用纤维素酶将其水解成葡萄 糖，进一步发酵生产乙醇、有机酸、单细胞蛋白等，对于解决当前人类面 临的粮食与能源短缺、环境污染等问题，促进可持续发展等具有重要意义。

纤维素的酶法水解工艺目前面临的主要问题是纤维素酶的用量大、成 本较高。纤维素酶是一种诱导酶，目前普遍通过里氏木霉(Trichoderma reesei)以纤维素为碳源和诱导物合成。由于纤维素是不溶于水的高分子 固体物质，加入发酵罐内会造成传质阻力大的问题，因此不适于高浓度发 酵。在可溶性碳源中，葡萄糖有利于菌种的生长，但对纤维素酶的合成有 抑制作用，已发现槐糖、纤维二糖、乳糖等对纤维素酶的生产有诱导作用， 但由于其价格昂贵，直接使用会导致发酵成本过高。

黄振艳等公开了一种制备纤维素酶可溶性诱导物的方法(黄振艳，夏 黎明.葡萄糖转苷酶制备纤维素酶可溶性诱导物的研究.高校化学工程学 报200.923(2)270～273)，该方法以葡萄糖为原料，利用葡萄糖转苷酶 的催化作用制备纤维素酶的可溶性诱导物。经高效液相色谱分析，发现转 糖苷产物中含有纤维素酶的强诱导物槐糖。将葡萄糖经转苷酶作用后的复 合物在批式发酵工艺(batch process)中用于纤维素酶的生产，发现产酶 时间可明显提前，但由于可溶性碳源易被利用，随着诱导物的逐渐被消耗， 酶活力不再上升，缺乏后劲。葡萄糖经转苷酶作用后的复合物中仍含有大 量葡萄糖，高浓度葡萄糖对纤维素酶的形成有抑制作用。如何使复合物中 少量的槐糖发挥出诱导作用，同时避免葡萄糖对纤维素酶形成的抑制作 用，是一个急需要解决的技术问题。

纤维素酶是一种复合酶，它主要包括内切型～β～葡聚糖酶(Cx)， 外切型～β～葡聚糖酶(C1)和纤维二糖酶。在降解纤维素的过程中，需要这 三种组分之间的协同作用。已有研究表明：碳源性状对纤维素酶的酶系构 成有明显影响，不同碳源条件下形成的纤维素酶对纤维素底物的降解性能 也有明显区别。

发明内容

本发明提供了一种高效生产纤维素酶的方法，通过特有的培养基配方 及流加调控发酵技术，解决了纤维素酶生产中单纯利用纤维素固体物料或 可溶性糖作为碳源及诱导物所存在的问题，使菌种的生长与目的代谢产物 的形成过程达到一定的协调平衡，有效提高纤维素酶的发酵水平。

一种高效生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：

将里氏木霉(Trichoderma reesei)接种至发酵培养基中，发酵60～90小 时后开始流加培养，流加培养过程中，当发酵液pH值高于4.8时，流加 培养基，当发酵液pH值低于4.5时，停止流加培养基，总发酵时间达到 192～240小时，停止发酵。

所述的发酵培养基配方为：

可溶性碳源10～25g/L、不溶性碳源20～35g/L、硫酸镁0.5～1.0g/L、 磷酸二氢钾4～8g/L、土温801～4g/L、酵母粉15～20g/L，蛋白胨10～ 15g/L、硫酸铵2～4g/L、氯化钙0.2～0.8g/L、FeSO₄·7H₂O 3～7mg/L、 ZnSO₄·7H₂O 1～2mg/L，MnSO₄·H₂O 1～2mg/L、CoCl₂·6H₂O 3～4mg/L、钼酸 铵1～2mg/L、H₃BO₃0.2～0.6mg/L。

流加培养过程中流加的培养基配方为：