[发明专利]HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，其特征在于：该重组溶瘤腺病毒基因 组中由上游至下游依次包含启动子、腺病毒E1A全长编码基因和HSV1-TK全 长编码基因。

2.根据权利要求1所述的HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，其特征在于： 所述启动子为CMV启动子。

3.权利要求1所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法，其特征在 于：包括以下步骤：

a、克隆两端分别带有Not I酶切位点和Xhol I酶切位点的HSV1-TK全长 编码基因；

b、克隆两端分别带有Xba I酶切位点和Sal I酶切位点的E1A全长编码基 因；

c、将两端分别带有Xba I酶切位点和Sal I酶切位点的E1A全长编码基因 用Xba I和Sal I双酶切后，插入经相同限制性内切酶处理的腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV中，得重组质粒pAdTrack-CMV-E1A；再将两端分别带有Not  I酶切位点和Xhol I酶切位点的HSV1-TK全长编码基因用Not I和Xhol I双酶 切后，插入经相同限制性内切酶处理的重组质粒pAdTrack-CMV-E1A中，得重 组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E1A-TK；

d、将重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E1A-TK与腺病毒骨架质粒 pBHGE3共转染人胚胎肾293细胞进行细胞内同源重组，待出现明显细胞病变 效应时收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上 清液，即得HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒。

4.根据权利要求3所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法，其特 征在于：步骤a的具体方法为：以HSV1基因组DNA为模板，以5′-tagcggcc- gcatggcttcgtacccctgccatc-3′和5′-gcctcgaggttagcctcccccatctc-3′为上下游引物，PCR 扩增HSV1-TK全长编码基因，PCR循环条件参数为：94℃预变性5分钟，然后 94℃变性60秒，56℃退火90秒，72℃延伸75秒，共35个循环，最后72℃延 伸20分钟。

5.根据权利要求3所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法，其特征 在于：步骤b的具体方法为：以含有E1A全长编码基因的pXC1质粒为模板，以 5’-gctctagaaccatgagacatattatc-3’和5’-gcgtcgacttatggcctggggcg-3’为上下游引物， PCR扩增E1A全长编码基因，PCR循环条件参数为：94℃预变性5分钟，然后94 ℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，共30个循环。

6.权利要求1所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应 用。