[发明专利]HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组溶瘤腺病毒，特别涉及HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒， 还涉及该重组溶瘤腺病毒的制备方法和应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，肿瘤治疗新方法的研究一直是医学和生 命科学研究的重点。肿瘤的生物治疗已被世界医学界公认为是继手术、放射治 疗和化学治疗之后的第四大治疗方法，其中免疫治疗与基因治疗更是生物治疗 中最有效、最前沿的科研项目。

肿瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其表达 此基因而获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达 到治疗之目的。基因治疗主要涉及目的基因、载体及受体细胞三方面。载体影 响目的基因导入和表达的效率，是决定肿瘤基因治疗成败的关键因素。载体可 分为病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体又可分为复制型病毒载体和复制缺 陷型病毒载体。为了确保在体治疗的安全性，传统的病毒载体采用复制缺陷型 病毒载体，但其在技术上很难达到100％的转染效率。近年来，随着现代生物学 和医学技术的发展，复制型病毒载体在肿瘤基因治疗中备受瞩目。

溶瘤病毒是一种通过遗传学改变而具有复制能力的病毒，不仅能够利用肿 瘤细胞中抑癌基因的失活或缺陷，选择性地在肿瘤细胞内复制，最终导致肿瘤 细胞的溶解和死亡，而且能够通过死亡的肿瘤细胞释放出病毒颗粒，产生级联 效应，放大溶细胞效果，直至肿瘤细胞被全部清除。此外，肿瘤细胞的破裂会 释放出肿瘤抗原，从而诱导机体抗肿瘤免疫反应，这也可能增强病毒的溶细胞 效果。利用这种病毒进行的肿瘤治疗称为溶瘤病毒治疗。既往研究证实，溶瘤 病毒能够在强力杀死癌细胞的同时确保不伤害正常细胞。

在肿瘤基因治疗中，自杀基因疗法近年来也显示出较好的应用前景。该法 采用药物敏感基因(即自杀基因)转染肿瘤细胞，以提高肿瘤细胞对无毒的前 体药物的敏感性，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。至今已发现多个自杀基因， 其中研究最多的是胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因。目前用于基因治疗的TK基因 为病毒TK基因，包括单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV1-TK)基因和水痘带状 疱疹病毒胸苷激酶(VZW-TK)基因等，尤以前者应用最多。HSV1-TK基因转 录部分约1300个核苷酸，蛋白质编码区为1128个核苷酸，编码376个密码子，基 因中无内含子，其转录起始部(Mrna5p端)有107个核苷酸的非翻译区。用于 HSV-TK基因疗法的前体药物包括丙氧鸟苷(GCV)和无环鸟苷(ACV)等，其 中GCV对HSV-TK转基因瘤细胞的抑制作用比ACV强10倍，为目前HSV-TK基因 疗法中最常用的前体药物。GCV和ACV本身对细胞无毒害作用，TK可以将其磷 酸化为二磷酸核苷，后者在细胞内激酶作用下形成三磷酸核苷，三磷酸核苷具 有强烈的细胞毒性，能抑制DNA聚合酶活性或作为DNA链延伸的终止子阻止 DNA合成，最终导致细胞死亡。这种独特的自杀效应能选择性地杀死肿瘤细胞 而保护正常细胞，从而避免了传统肿瘤治疗方法对人体带来的伤害。此外，研 究还表明，转导了自杀基因的肿瘤细胞在给予前体药物后被杀死，其相邻或更 远的未被转染的肿瘤细胞也可被杀死，这种作用被称为旁观者效应。旁观者效 应明显扩大了自杀基因的细胞杀伤范围，显示了其对于肿瘤治疗的独特优势， 并大大克服了自杀基因转染率的限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒， 有效结合自杀基因和溶瘤病毒的特性，转染效率高，稳定性好，肿瘤治疗谱广； 目的之二在于提供所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法；目的之三在 于提供所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，该重组溶瘤腺病毒基因组中由上游至 下游依次包含启动子、腺病毒E1区基因和HSV1-TK全长编码基因。

进一步，所述腺病毒E1区基因为E1A全长编码基因；

进一步，所述启动子为CMV启动子。

2、所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

a、克隆两端分别带有Not I酶切位点和XholI酶切位点的HSV1-TK全长 编码基因；

b、克隆两端分别带有Xba I酶切位点和Sal I酶切位点的E1A全长编码基 因；