[发明专利]鲑鱼肾杆菌实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及微生物的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及鲑鱼肾杆菌实时荧光RT-PCR检测法和试剂盒。

背景技术

细菌性肾病(Bacterial Kidney Disease，BKD)又称Dee病，是由鲑鱼肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)引起鲑科鱼类的一种慢性传染病。1930年首次报道BKD在棕鲑、虹鳟和溪鳟中发生。此后，在加拿大、智利、英国、法国、德国、冰岛、意大利、西班牙、南斯拉夫等地养殖的14种鲑科鱼类均有发生(Austin，B.Austin，D.A.Baterial Fish Pathogens：Disease ofFarmed and Wild Fish[M].Praxis Publishing Ltd，Chichester，1999，17-18.)。鲑鱼肾杆菌属于革兰氏阳性细菌，对人工养殖和天然的许多种鲑科鱼类，尤其是大麻哈鱼造成巨大的经济损失。Evenden等报道，BKD可对太平洋鲑鱼(Oncorhynchus spp.)和大西洋鲑鱼(Salmo salar)的野生种群造成80％和40％的损失(Evenden，AJ，Grayson TH，Gilpin ML，et al.Renibacterium salmoninarum and bacterial kidney disease-the unfinishediigsaw[J].Annu Rev Fish Dis，1993，3：87-104)。BKD潜伏期长，常呈慢性感染，此时，病鱼没有任何外部症状，或者仅仅出现体表变黑、腹水、贫血、轻度溃疡等症状，但在适宜温度(13～18℃)下，鲑鱼肾杆菌能引起鲑科鱼类急性发病，大量死亡。

鲑鱼肾杆菌的生长条件苛刻，生长速度缓慢，造成对该病的诊断十分困难。目前的诊断方法主要依靠常规的细菌分离鉴定和免疫学技术(直接荧光抗体试验、间接荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验)。但这些方法费时费力，灵敏度低，特异性较差，难以满足鲑鱼肾杆菌的流行病学调查、现场诊断和口岸快速检测的需要。因此，迫切需要建立检测周期短、灵敏度高、特异性强的检测方法。

实时荧光技术，是近年来新问世的一种高敏感性的检测技术，它融合了PCR技术的核酸高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，它可以做到每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，做到真正意义上的定量。同时该技术在密闭系统内完成检测，不需要常规PCR的电泳观察环节，减少了对工作环境的污染，降低假阳性结果发生。因此，自从该技术建立以来，迅速、广泛地应用于植物、动物和人类的寄生虫，病毒和细菌等病原的检测研究中。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够快速、高灵敏度的鲑鱼肾杆菌实时荧光RT-PCR检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种鲑鱼肾杆菌的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了鲑鱼肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括利用特异性探针和引物对，以细菌DNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应，所述引物对分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列；

Seq ID No.1：5’-CCG AAG AGC CCA CCA ATG AC-3’

Seq ID No.2：5’-GAC TTA GAC GAC GCC GTA GC-3’

所述探针为能与鲑鱼肾杆菌的基因组DNA位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为15～30bp的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

优选的，所述探针含有Seq ID No.3所示的序列，

Seq ID No.3：5’-CGG ATT GCC GTC GCC GCA GC-3’。

在本发明的具体实施方式中，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

所述RT-PCR反应的引物终浓度优选为0.9～1.1μmol/L，更优选1.0μmol/L；探针终浓度为0.09～0.11μmol/L，更优选0.1μmol/L。

所述RT-PCR的反应的退火温度优选为53℃～57℃，更优选55℃。

在本发明一个具体的实施方式中，所述RT-PCR的反应条件包括：50℃，2min；94℃，10min；40循环：94℃20s，55℃40s。