[发明专利]用多醛基化合物制备红细胞代用品的方法

说明书

一种用多醛基化合物制备红细胞代用品的方法，本发明在聚合血红蛋白反应中，降低反应底物的浓度，将多醛基化合物溶液快速加至血红蛋白溶液中反应；终止反应后获得分子量在100～1500kDa之间的血红蛋白聚合物；与现有技术相比本发明具有：①快速加入多醛基化合物，极大地缩短了聚合过程，能够缩短生产周期、降低成本；②由于反应液中多醛基化合物在相对较长的时间内维持较高浓度，具有灭活病毒的功能；③血红蛋白分子的90％以上被分子内交联，使得血红蛋白的结构稳定；④较高的pH值，可以提高反应液中游离多醛基化合物的浓度，降低分子间未交联血红蛋白的含量，能够降低毒性；⑤聚合后的血红蛋白平均分子量明显增大，其半衰期可达到18～25h，更有利于临床的应用。

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种以血红蛋白为基质的红细胞代用品(血液代用品)的制备方法。

背景技术

输血在临床手术、抗灾、恐怖袭击和战地救护中都是非常重要的医疗手段，目前主要是靠人们献血来满足需求。由于人类的血型复杂，输血时必须进行配型，并且血液的储存期短、运输不便、来源有限，还存在有艾滋病、乙肝等病毒传染的潜在危险，这些都使得血液在突发事件的紧急救护受到限制，尤其是紧急状态的大量使用。近年来，随着血液需求量的不断增高，仅靠人类自身献血很难满足日益增长的需求，因此开发安全有效的血液代用品对于缓解上述问题有着重要的意义。

无基质血红蛋白(stroma-free hemoglobin，SFH)具有携氧释氧功能，一直以来被作为氧载体制剂用于代替红细胞功能的研究，具有潜在的临床应用价值。由血红蛋白制备的代替红细胞功能的制剂被称为血红蛋白氧载体(Hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)，其具有能够被消毒、容易储存、无需交叉配型的特点，特别适合于突发事件中的紧急使用。

但是将无基质血红蛋白直接用于人体存在有以下问题：第一，会产生很强的毒性，主要表现为血尿、血压升高、腹痛、肾衰竭甚至死亡，主要原因是由于四聚体血红蛋白分子(64kDa)容易解离成为分子量较小的二聚体(32kDa)，这些小分子容易从血管内皮的细胞间隙渗出，引起上述毒副反应；第二，无基质血红蛋白在机体内的滞留时间非常短，半衰期只有约4h，不能满足临床使用的要求，原因在于血红蛋白是由四个亚基组成的蛋白(分子量为64kDa)，四个亚基分别由两对αβ亚基组成，αβ亚基之间是由离子键、疏水作用力和范德华力而不是共价键将其作用在一起，所以容易解离成二聚体的αβ亚基，引起上述毒性。

因此在设计HBOCs分子时，主要通过稳定血红蛋白四聚体并增加分子量和分子半径的手段来克服天然血红蛋白的缺陷。在稳定血红蛋白四聚体的试剂中，常用的是多醛基化合物(如戊二醛)；血红蛋白有40个左右的赖氨酸的氨基暴露在血红蛋白表面，多醛基化合物可以与这些氨基反应，形成不均一的聚合物分子。在目前所有制备红细胞代用品的技术中，多醛基化合物的加入都是采用滴加方式，使得聚合反应的过程时间较长，如美国专利5,895,810记载了一种用戊二醛交联血红蛋白的方法，其聚合反应的过程超过了6个小时，这不利于工业上的大量生产。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用多醛基化合物制备红细胞代用品的方法，使其提高聚合反应中分子内的交联效率，缩短聚合反应的过程，降低生产成本，并具有灭活病毒的作用。