[发明专利]铁皮石斛原球茎的间歇式发酵培养方法

说明书

技术领域

本发明专利申请涉及一种中药材的组织培养技术，尤其涉及中药材铁皮石斛组织培养中的中间产物原球茎的培养技术。

背景技术：

铁皮石斛为中华十大仙草之首，国家三级重点保中药材，为历代中国药典收录，由于自然繁殖率低下，随着市场需要量的增加，其野生资源由于过度采集，已接近绝迹。为了发展这一名贵的中药材，近年来许多厂家都采用现代生物技术对其进行了快速繁殖研究，纵观这些研究机构，多数以原球茎的方式进行扩繁，并且培养中多用固态或液态摇床的方式进行培养，并且培养的目的一般是为了生产铁皮石斛种苗。

为了更好的发展这一名贵中药材，本公司在长期的铁皮石斛组织培养过程中总结出一套适合铁皮石斛发展潮流的培养技术。

本发明专利是本公司在长期的铁皮石斛组织培养过程中总结出来的，在这个过程中，首先对现有的铁皮石斛种内群体进行了初步调查，选择品质好的铁皮石斛为外植体，然后通过多次诱导与培养形成，选择不容易产生芽，但生长速度快，多糖含量高度铁皮石斛原球茎进行培养，并对最佳培养基进行筛选，最后实现铁皮石斛原球茎的间歇式发酵罐大规模培养。

发明内容：

铁皮石斛石斛原球茎的诱导，本发明中所用到的培养物的诱导材料为铁皮石斛茎段或种子，诱导时采用固态培养基，进行诱导所用的培养基为间歇式发酵培养基(4.0～8.0)g/L的琼脂间歇式发酵培养用的培养基为大量减半的基本MS液体培养基加入0～1.0的生长素并加入100g/L的香蕉汁，其中蔗糖的浓度为20～40g/L；配置好的培养基密封好后，采用高压蒸汽的方式进行灭菌，灭菌时间为15-30min；培养用的反应器为间歇式生物反应器，其特征为培养物在培养过程中不是一直浸泡在液体培养基中，而是浸泡与非浸泡过程交替进行，这种交替的实现是通过每天向培养容器中通入液体培养基3～24次，每次1～10min的方式实现的；用于间歇式发酵培养的原球茎为固态培养基中诱导得到的培养物中生长速度快，芽点较大，芽数较少的铁皮石斛原球茎；原球茎的培养方式为间歇式发酵培养，培养温度为23～17℃。光照时间为6～18h/d；每隔20～60天更换培养基一次；对培养好的培养物进行收集时直接从反应器中倒出，收集得到的铁皮石斛原球茎可以作为野生或人工种植的铁皮石斛药材的替代品使用。

实施实例一：

1.培养物的诱导：

选择近成熟但为开裂的果实采用常规方法消毒后，抛开接种到诱导培养基中进行诱导，用于原球茎诱导的培养基为大量减半的MS培养基加入0.2mg/L的NAA和100g/L的香蕉汁，每个果实接种1瓶，45天后进行转接，此时使用的培养基为生长素浓度升高的培养基，即大量减半的MS培养基加入0.4mg/L的NAA和100g/L的香蕉汁，以后每隔45天继代一次，培养基不变，继代中选择芽数比较少生长速度比较快的原球茎进行继代。经过三次以上的继代以后，生长稳定的原球茎即可用于间歇式发酵培养。

2.间歇式发酵培养：

选择生长速度快，芽点少，生长稳定的原球茎进行发酵培养，培养容器容积为250ml加入培养物10g，培养基储存瓶溶剂为250ml，加入培养基的量为100ml，培养条件为每光照14小时，温度为25±1℃，培养时间为45天，45天后即可对培养物进行收集。收集时每个反应器可得细胞培养物约90g。

实施实例二：

1.培养物的诱导：

选择铁皮石斛幼嫩茎段常规方法消毒后，抛开接种到诱导培养基中进行诱导，用于原球茎诱导的培养基为大量减半的MS培养基加入1.0mg/L的NAA，0.1/L的6-BA和100g/L的香蕉汁，每个瓶接种外植体5段，45天后进行转接，此时使用的培养基为生长素浓度升高的培养基，即大量减半的MS培养基加入2.0mg/L的NAA和100g/L的香蕉汁，以后每隔45天继代一次，培养基不变，继代中选择芽数比较少生长速度比较快的原球茎进行继代。经过三次以上的继代以后，生长稳定的原球茎即可用于间歇式发酵培养。

2.间歇式发酵培养：

选择生长速度快，芽点少，生长稳定的原球茎进行发酵培养，培养容器容积为250ml加入培养物10g，培养基储存瓶溶剂为250ml，加入培养基的量为100ml，培养时间为45天，45天后即可对培养物进行收集。