[发明专利]一种植物样品中吲哚乙酸含量的酶传感测定方法

说明书

技术领域

本发明属于植物激素检测领域，具体涉及一种植物样品中吲哚乙酸含量的酶传感测定方法。

背景技术

自1928年发现生长素以来，与植物激素有关的研究几乎已涉及到植物学研究的所有领域，植物激素及其作用机理的研究已成为人们认识和理解植物生命现象的重要途径，为作物遗传改良提供了强有力的理论支撑，在推动“绿色革命”、大幅度提高作物产量和保证国家粮食安全方面发挥了不可替代的作用。近年来，随着植物分子生物学和基因组学的发展，以拟南芥和水稻为代表的模式植物基因组研究不断取得突破，使本身就处于科学前沿的植物激素研究进入了全新的快速发展阶段。与此同时，作为关键支撑技术的植物激素成分分析及检测方法已开始成为开展植物激素研究领域的限制因子之一。

吲哚乙酸(Indole-3-AceticAcid，IAA)是第一种被发现的属于生长素类的植物激素，能诱导基因的表达，启动一系列生长发育的反应，如细胞伸长、分裂、维管分化、顶端优势及根系的形成等，在植物生长发育过程中起重要的调控作用。1928年，Went通过著名的燕麦芽鞘弯曲实验而首次建立了检测植物生长素的生物测试法。除此之外，常用于测定IAA等植物激素的传统方法还有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用(GC/MS)或液-质(LC/MS)联用、酶联免疫(ELISA)、放射免疫(RIA)等方法。这些方法各有优点，但都存在一定的局限性。其中，生物试法简单易行，能反映被测植物激素的生理活性，但不能排除植物激素类似物和拮抗物的影响，专一性和灵敏度均较低；色谱法灵敏度高、重现性好，但对待测样品需要量大、样品前处理复杂且需要昂贵的仪器设备和较高的使用维护费用；酶联免疫法和放射免疫法灵敏度较高，但抗体制备和纯化较为困难、测定周期长且很难排除植物激素前体物和结构类似物的影响。而且，酶联免疫法的重现性受环境条件影响较大，放射免疫法还存在放射性废物处理的问题。

植物激素与生长发育湖南省重点实验室所研制的植物激素免疫传感测定方法是继生物试法、物理化学方法、酶联免疫与放射免疫等方法之后，在植物激素测定方法领域的重大创新与突破，如所研制的植物激素免疫传感器可以直接测定出提取液中不同植物激素含量，且结构简单、制造简便和操作方面。本发明力图建立一种IAA含量的酶传感测定方法。

发明内容

本发明目的是提供一种能克服现有检测技术的不足(测定时间长、成本高、操作繁琐等)、快速和高灵敏检测IAA的新方法。

为了解决所述技术问题，这种酶传感检测IAA的方法主要包括以下步骤来实现：(1)酶传感器：将铂电极依次用金相砂纸、含氧化铝悬浮液的麂皮进行粗磨和抛光成镜面，洗净后进行硫堇电聚合和戊二醛共价交联吲哚乙酸氧化酶或辣根过氧化物酶后待用；(2)绘制标准曲线：利用所构建酶传感器测定一系列不同浓度的IAA，根据电流变化与IAA浓度之间的关系绘制标准曲线；(3)用所构建的酶传感器检测样品的电流变化，根据标准曲线计算IAA浓度。

本发明方法步骤(1)中所述IAA电化学酶传感器的构建采用以下步骤(图1)：①电极的修饰：以铂电极(Platinum Electrode，Pt)作为传感器的基体电极，使用前电极需要依次经过6号金相砂纸、含1.0、0.3和0.05μm氧化铝悬浮液的麂皮上进行粗磨和抛光成镜面，并用水、乙醇超声清洗电极表面；②硫堇电聚合：将洗净后的Pt电极置于三电极体系中浸泡在5mL、含有5mmol/L的硫堇溶液和pH＝4.5醋酸-醋酸钠溶液当中，在-0.4～1.2V的电位范围内，以0.05V/s的扫描速度进行循环扫描。然后用双蒸水冲洗电极表面并干燥；③戊二醛共价交联：在电极表面滴加16μL浓度为2.5％的戊二醛溶液，在室温下静置1h。接着，洗净电极表面，吹干。取吲哚乙酸氧化酶或辣根过氧化物酶16μL，滴加于电极表面，置于人工气候箱(37℃)中温育1h后待用。