[发明专利]一个定向突变及遗传改造的重组质粒及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术，涉及利用位于该质粒上一段基因片段来制作耐辐射球菌基因突变株及转基因遗传改造耐辐射球菌成为工程细菌的筛选标记。

背景技术

目前，耐辐射球菌属(Deinococcaceae)已经发现八个种，D.radiodurans，D.proteolyticus，D.radiopugnans，D.grandis，D.geothermalis，D.murrayi，D.radiophilus，D.radiotolerance。尽管它们形态各异，但都有一个共同的生理特性，就是显示出极强的电离辐射抗性。其中Deinococcus radiodurans(DR)是1956年由美国科学家Anderson等从X-射线灭菌处理后的肉罐食品中发现的一种红色的非致病性球菌，最适生长温度为30℃。耐辐射球菌是最具辐射抗性的生物体之一，在5kGy的电离辐射下，对数生长期的耐辐射球菌细胞不受任何影响，它可以长期正常生长于60Gy/h高辐射背景的环境之中。稳定生长期的耐辐射球菌可以耐受15kGy的辐射剂量，是大肠杆菌的100多，是人类的1000倍。1999年D.radiodurans的基因组测序完成。该细菌除了对抗由电离辐射，对亚硝基胍、羟胺、甲基硝基亚硝基胍和氧基硝基喹啉等化学毒剂也具有相当抗性。因此，自从耐辐射球菌被发现以来，倍受微生物学家、放射生物学家和肿瘤研究人员的重视。有人已经开展研究使其成为核爆地区等高辐射污染地区的生物修复候选人，也有人研究使其某些特定基因用于生产物种的转基因改良，比如作物的抗干旱。

该菌的生物学特征是，与其他物种比较，它具有超强的耐辐射能力和DNA修复能力。该生物已经成为研究DNA损伤修复的模式生物，也有学者认为该生物DNA损伤修复方式可以为癌症的研究提供模型。基因突变尤其定向的基因敲除是研究功能基因的重要手段，利用本发明的质粒所搭载的卡那霉素抗性筛选标记来构建功能基因的突变株。另外，由于耐辐射球菌具有相当强的抗辐射、抗化学毒剂的能力，很多生物工程的研究者已经试图将该细菌改造成为在核实验基地等高辐射背景下开展生物修复的工程细菌。由美国国防部资助的项目已取得不错的进展，由该细菌改造成的工程菌可以富集铀等放射性原素。而在工程菌遗传改造过程，合适筛选标记是其中重要的因素。

研究某些特定基因时，对目标基因进行突变从而试图研究其生物学特性是常用手段，现在也有商业化的包含筛选标记的质粒。用于该细菌基因突变有特殊转座子随机插入基因，该方法是随机的，实际操作中不适于基因的定向突变。而利用筛选标记基因结合特殊启动子根据同源重组的原理进行目标基因的靶向突变和基因组遗传改造是一种重要技术。在此方法中，选择合适的筛选基因以及合适的启动子部是其中的重要环节。

发明内容

本发明的目的是提供一个定向突变及遗传改造的重组质粒，是用于耐辐射球菌目的基因定向突变和染色体遗传改造的重组基因，具有SEQ ID№：1的核苷酸序列，是表达耐辐射球菌热激蛋白GroEL基因的启动子PgroEL与卡那霉素抗性基因KanR的融合DNA片段。本发明中耐辐射球菌的菌株分类为Deinococcus radiodurans，保藏号为：ATCC NO.13939，菌种编号为R1，购于国家菌种保存中心；质粒名称：pRADK，筛选基因：卡那霉素抗性基因(KanR)，启动子：表达耐辐射球菌热激蛋白GroEL基因(DR0607)启动子PgroEL。

所述质粒通过以下步骤获得：构建PgroEL启动子与卡那霉素结构基因的紧密融合，并在接合位点作了变动，PgroEL启动子核糖体结合位点(RBS)后的CACATG替换成CATATG(即NdeI酶切位点)，该酶切位点的后三个碱基ATG作为卡那霉素抗性基因起始翻译位点。利用以D.radiodurans R1基因组为模板，设计克隆GroEL启动子PgroEL的引物：上游引物P1：5’CATAGAAGCTTCGTATTGTCGCCCTACATA T3’，下游引物P2：5’GATCAAGCATATGGGGTCCTCCTGTG 3’，PCR扩增GroEL的启动子片段S1；同时以pET-29b质粒为模板，上游引物P3：5’TCATCACATATGAGCCATATTCAACGGG AAACGTC 3’，下游引物P4：5’ACAGACGGATCCTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA TG 3’，克隆卡那霉素抗性基因S2。两段PCR产物S1与S2经NdeI酶切后连接，以连接产物作模板，P1与P4为引物进一步扩增得PCR产物S3，即为含有GroEL启动子的卡那霉素抗性基因的DNA片段。