[发明专利]利用高产富硒功能杂交红米米糠自发酵液生产松茸多糖

权利要求书

1.利用高产富硒功能杂交红米米糠自发酵液生产松茸多糖的方法，其特征是高产富硒功 能杂交红米611A/R319米糠自发酵液的制备和深层液体发酵法培养松茸菌丝体，其中高产富 硒功能杂交红米611A/R319米糠富含有适宜松茸菌生长所需的微量元素，利用其自身的酶类 水解后制备成高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液；将松茸菌孢子接种至新鲜的 试管斜面上进行培养，待斜面长好后接种至液体培养基中进行种子液的培养；再通过三级培 养，最后转至3000L发酵罐中进行深层液体发酵培养，其中发酵液体培养基中的土豆汁用高 产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液替代，使松茸菌充分利用高产富硒功能杂交红 米611A/R319米糠中的营养元素，从而快速大量生长出松茸菌丝体；发酵结束后，收集菌丝 体和发酵液，并分别用超声波辅助热水浸提法和乙醇醇提法从菌丝体和发酵液中提取松茸胞 内粗多糖和胞外粗多糖，将二者合并得到产品松茸粗多糖；步骤为：

1)高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液制备：

取高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠，60目过筛，按1∶15的料液比加水混合均匀， 于40℃水浴保温3h，利用米糠自身的酶类水解淀粉和蛋白质，后纱布过滤得红米糠自发酵 液；

2)菌种培养：

出发菌株为松茸(Tricholoma matsutake Sing.)；

①斜面培养：

培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵 0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，琼脂20，pH自然；

培养方法：将保存的松茸菌种斜面接种到新鲜的空白斜面上，在24℃下培养7-10天；

②500mL一级摇瓶种子培养，装液量200mL：

培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵 0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，pH自然；

培养方法：将培养好的菌种斜面接种至已灭菌的摇瓶中，在24℃，转速120rpm下培养 7天；

③5000mL二级摇瓶种子培养，装液量2000mL：

培养基配方以g/L计：葡萄糖20，硫酸镁2.38，氯化钙1，磷酸二氢钾0.5，磷酸二氢铵 0.4，硝酸钾0.5，土豆汁200，麦芽汁120，维生素B₁0.01，pH自然；

培养方法：将培养好的一级种子按10％的接种量接种至已灭菌的摇瓶中，在24℃，转速 120rpm下扩大培养5天，即成摇瓶种子液；

3)三级发酵培养：

①50L一级发酵种子罐培养，装液量25-30L：

一级发酵种子罐培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液 200，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁， 玉米粉5，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa 下灭菌30min，冷却后按10％的接种量接入摇瓶种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量 1∶0.3，V∶V，搅拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间45-48h，菌丝球上浮三分之一，镜检 有锁状联合，无杂菌；

②500L二级发酵种子罐培养，装液量250-300L：

二级发酵种子罐培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液 200，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁， 玉米粉5，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa 下灭菌30min，冷却后按15％的接种量接入一级种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量 1∶0.3，V∶V，搅拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间35-40h，菌丝球上浮三分之一，镜 检有锁状联合，无杂菌；

③3000L发酵罐培养，装液量1800L：

发酵培养基配方以g/L计：高产富硒功能杂交红米611A/R319米糠自发酵液200，葡萄 糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5， 麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母粉3，豆油2，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30min， 冷却后按15％的接种量接入二级种子，温度24℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3，V∶V，搅 拌转速120rpm，转罐标准：发酵时间55-60h，pH5.0，平板无杂菌，菌丝球上浮二分之一， 镜检有锁状联合，菌丝球不能自溶；

4)松茸多糖的提取：将培养好的发酵液在5000-6000rpm下离心处理，分别收集好发 酵液和菌丝体，菌丝体冻干保存；

①胞内粗多糖的获取：将收集到的菌丝体粉末按1∶30的料液比加入蒸馏水，用频率25 Hz、功率400W的超声波处理30min，后于90℃水浴中浸提多糖1.5h，然后于4800rpm离 心15min，弃沉淀，上清液在0.095MPa，50℃下浓缩至原体积的1/2，再将浓缩液与95％乙 醇按1∶3的体积比混合，置4℃下沉淀12h，在4800rpm离心15min，弃上清液，沉淀中加 50mL蒸馏水使其重新溶解，按5∶1加入Sevag试剂脱蛋白，Sevag试剂即是氯仿与异戊醇按 4∶1的混合液，然后加3倍体积的乙醇在4℃下沉淀12h，4800rpm离心15min，沉淀经真 空冷冻干燥后得松茸胞内粗多糖；

②胞外粗多糖的获取：将收集到的离心后的发酵液减压浓缩为原体积的五分之一后，用 3倍体积的95％乙醇醇提12-16h，然后用5000-6000rpm离心20-30min，收集沉淀，将 沉淀用少量蒸馏水复溶后冷冻干燥，即得松茸胞外粗多糖；

③产品的获得：将提取得到的松茸胞内粗多糖和松茸胞外粗多糖二者合并，即得产品松 茸粗多糖。