[发明专利]一种与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR分子标记

权利要求书

1.一种与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR分子标记，其特征在于，由序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成的引物对PCR扩增得到。

2.权利要求1所述的分子标记，是用RAPD分子标记方法筛选出S229₇₀₃分子标记，再将S229₇₀₃转换成稳定的SCAR标记，该SCAR标记采用下列方法步骤获得：

(1)所用材料为药用野生稻1665(Oryza officinals Waii Ex Wat t)与栽培稻桂99远缘杂交的B3F4代自交分离群体，

(2)用CTAB法提取水稻总DNA，分别溶于1×TE中220℃保存备用，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测水稻总DNA的完整性，并根据EB染色强度计算其浓度，

(3)采用RAPD分子标记方法，对与水稻抗褐飞虱相关的分子标记的筛选，

(4)选出一个RAPD分子标记S229₇₀₃，该标记与水稻抗褐飞虱基因相连锁，与抗性基因的遗传距离为10.1CM，

(5)将S229₇₀₃克隆测序后，根据所测序列，设计引物SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，以水稻总DNA为模板，PCR扩增得到SCAR标记，即SCAR₆₉₄。

3.按照权利要求1所述的与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR分子标记，其特征在于，用RAPD分子标记方法，进行与水稻抗褐飞虱相关的分子标记，其筛选的具体做法是：选取B3F4代自交分离群体中10株不抗褐飞虱植株总DNA混合作为不抗池DNA，10株抗褐飞虱植株总DNA混合作为抗池DNA，用每一条RAPD引物分别对不抗池DNA和抗池DNA分别进行RAPD PCR，PCR扩增反应体系建立：10×buffer 2uL 2.5mM dNTP 2uL 10pM RAPD primer 1uL总DNA(20～50ng/uL)1uL ExTaq(0.5u/uL)2uL，加ddH20补足至20uL，95℃预变性5min，94℃30s，36℃30s，72℃1min 40个循环，然后72℃延伸10min，PCR反应扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳然后经EB染色检测。

4.按照权利要求2所述的与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR分子标记，其特征在于，将S229₇₀₃转换成稳定的SCAR₆₉₄标记，具体做法为：首先将标记S229₇₀₃克隆至克隆载体pGEM T-Easy vector上，按照BIORAD公司电脉冲仪的操作程序，采用电激法转化E.coliDH5α，在含有X-gal和IPTG的氨苄青霉素LA选择培养基上挑选白色菌落，并用限制性内切酶EcoRI酶切鉴定重组质粒，送宝生物工程大连有限公司测序，测序后，根据该序列设计2个SCAR引物P1和P2，在B3F4代自交分离群体的抗性单株中分别进行PCR扩增，均能扩增出预计的SCAR标记SCAR₆₉₄。