[发明专利]细菌快速鉴定的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括：

(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；

(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(3)亲和素标记的磁珠；

其中，SEQ ID NO：1在其5’端标记生物素；

在一次检测中共同使用。

2.根据权利要求1所述的细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：5％(w/v)Chelex 100缓冲液，20mg/mL蛋白酶K；

(2)反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：1～2，2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，2U/μLTaq DNA聚合酶；

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。

3.一种细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括权利要求1所述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：

(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对；

(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

(3)亲和素标记的磁珠；

其中，SEQ ID NO：3在其5’端标记生物素；

在一次检测中共同使用。

4.根据权利要求3所述的细菌快速鉴定的试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：5％(w/v)Chelex 100缓冲液，20mg/mL蛋白酶K；

(2)反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：3～4，2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，2U/μLTaq DNA聚合酶；

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。

5.一种细菌快速鉴定的试剂盒的检测方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)提取细菌DNA；

(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16S rRNA的V1可变区的PCR扩增；

(3)步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；

(4)将步骤(3)得到的纯化的PCR产物进行焦磷酸测序；

(5)测序结果与数据库比对判断种属。

6.根据权利要求5所述的细菌快速鉴定的试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR扩增体系为：10×buffer 5μL，SEQ ID NO：11μL，SEQ ID NO：21μL，Template 0.2ng，dNTPS 200mM，taqE 2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：95℃ 3min；94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 60s，40个循环；72℃ 10min。

7.根据权利要求5所述的细菌快速鉴定的试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5μL，SEQ ID NO：3 1μL，SEQ ID NO：4 1μL，Template 0.2ng，dNTPS 200mM，taqE 2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：95℃ 3min；94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 60s，40个循环；72℃ 10min。