[发明专利]细菌快速鉴定的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属临床微生物鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定医学病原菌的试剂盒及检测方法。

背景技术

传统的细菌培养和生化分析，已不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学研究，研究者不仅希望在分子水平上对各种细菌和病毒进行研究，同时希望检验方法更快速、准确，通量更高，人为影响因素要尽可能减少，便于构建标准化的操作流程。PCR以及定量PCR的方法无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，而且受检测菌种的限制，每种菌种需要特异的PCR引物和或探针，大大限制了其在细菌鉴定中的应用；而利用常规的DNA测序技术对大片段的DNA进行序列测定，在速度和消耗上不能满足对大规模样本快速检测的要求。在实际工作中，很短的一段保守/特异序列的测定就可满足对分子诊断的需要。由于16srRNA序列在所有的细菌种都存在，能够满足进行比较的要求，因此以16SrRNA序列分析为基础，采取毒力和毒素基因鉴定方法，在最短的时间内鉴定未知细菌，对细菌性新发传染病做出准确判定。焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于构建标准化操作流程，因此广受研究者青睐，并在很多方面已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药检测。

Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。

然而，传统细菌鉴定方法需要18～24小时，成本也较高，细菌经DNA抽提、通用引物扩增，然后用通用引物作为测序引物，测序结果与数据库比对判断型别。该方法能一次测序区分常见临床细菌，可用于细菌感染的临床诊断及耐药监测。迄今为止国内外未见一次测序区分常见临床细菌的产品和报道，因此临床上如果要快速获得细菌感染的信息，需要等18～24小时或更长时间而且成本较高，影响了诊疗效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种菌种快速鉴定的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种细菌快速鉴定的试剂盒，它包括：

(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；

(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(3)亲和素标记的磁珠；

其中，SEQ ID NO：1在其5’端标记生物素；

在一次检测中共同使用。

上述细菌快速鉴定的试剂盒，具体包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂：5％(w/v，即g/mL)Chelex 100缓冲液，20mg/mL蛋白酶K；

其中，Chelex 100缓冲液具体为：含0.03％(w/v，即g/mL)SDS，1％(v/v)Tween-20，1％(v/v)NP-40。

(2)反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：1～2，2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，2U/μLTaq DNA聚合酶；

其中，PCR Buffer具体为：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(w/v，即g/mL)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9Tricine。

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；

其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween-20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁。

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP(dNTP即dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)。

一种细菌快速鉴定的试剂盒，它包括上述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：