[发明专利]tGLP-1衍生物及其制备和应用

权利要求书

1.一种人GLP-1衍生物，其特征在于，所述衍生物的分子结构式为tGLP-1(7-38)，SeqID NO.2；其中，Xaa2是Ser；Xaa20是Gln；Xaa28是Asp；Xaa30是Thr，Asp，Ser，Ala，Gly，Leu，Gln，His中的任何一种；Xaa32是Cys。

2.如权利要求1所述GLP-1衍生物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建高效表达如权利要求1所述tGLP-1的基因工程菌

①根据如权利要求1所述tGLP-1的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，合成Seq ID No.4所示的片段，该片段含有肠激酶EK位点、tGLP-1基因、终止密码子TAA、限制性内切酶Bgl II、Spe I和HindIII位点；

将该片段克隆至pET32a(+)中，得到重组质粒pET32a-tGLP-1-C1；

用Xba I/HindIII酶切pET28a(+)和pET32a-tGLP-1-C1，将两者的酶切小片段和大片段分别回收并连接，得到重组质粒pET28a-tGLP-1-C1；

②构建含有单串tGLP-1基因的DNA序列的基因工程菌

将重组质粒pET28a-tGLP-1-C1转化BLR(DE3)，制得含单串tGLP-1基因的基因工程表达菌株；

③构建高效表达tGLP-1的基因工程菌

以P1，P2为引物，以含单串tGLP-1基因的pET28a(+)质粒为模板，进行PCR，最终得到Seq ID No.5所示的串联小片段；

P1：gggctagcaaacatagcgaaggcacctttac

P2：ggaagcttttaactagttttgcagccnnngccgtccac

其中，P1引入酶切位点Nhe I；

用Spe I/HindIII和Nhe I/HindIII分别酶切步骤②的重组质粒pET28a-tGLP-1-C1和Seq ID No.5所示的串联小片段，将Spe I/HindIII双酶切得到的大片段与Nhe I/HindIII双酶切得到的小片段连接，得到tGLP-1基因的二聚体重组质粒pET28a-tGLP-1-C2；重复上述酶切连接6次，分别得到tGLP-1基因的三聚体质粒pET28a-tGLP-1-C3，四聚体质粒pET28a-tGLP-1-C4，五聚体质粒pET28a-tGLP-1-C5，六聚体质粒pET28a-tGLP-1-C6，七聚体质粒pET28a-tGLP-1-C7，八聚体质粒pET28a-tGLP-1-C8；

将上述重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，得到高效表达tGLP-1的基因工程菌。

(2)液体培养

将步骤(1)所得的基因工程菌挑取单菌落于LB培养基中培养12-16小时，以1％转接入自诱导培养基中培养12-24小时，产生和积累以可溶形式或包涵体形式表达的tGLP-1融合蛋白；

(3)纯化得到高纯度tGLP-1

对于以可溶形式表达的融合蛋白，将湿菌体破壁，经镍柱亲和层析获得含tGLP-1融合蛋白的粗品；

对于以包涵体形式表达的融合蛋白，将湿菌体破壁，离心得到包涵体蛋白沉淀，用洗涤缓冲液洗涤包涵体，得到较高纯度tGLP-1包涵体；

(4)胰酶酶切得到tGLP-1

将蛋白稀释到4-5mg/ml，加入胰酶酶切，得到具备生物学活性的tGLP-1衍生物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述重组质粒是含有人tGLP-1衍生物基因的质粒pET28a(+)，所述人tGLP-1衍生物基因的串数为1-8串。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒为pET32a(+)-tGLP-1，pET28a(+)-tGLP-1。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的自诱导培养基包含有蛋白胨，酵母膏，Na₂HPO₄，KH₂PO₄，(NH₄)₂SO₄，NaCl，甘油，葡萄糖，乳糖，MgSO₄。