[发明专利]tGLP-1衍生物及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域的GLP-1衍生物及其制备和应用，尤其是涉及一种可口服的tGLP-1衍生物及其制备和应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus)一种常见慢性全身性的代谢性疾病，是由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征。是由于人体内胰岛素绝对或相对缺乏所至。它的临床表现大概包括两个方面，一是血糖高、尿糖多造成的“三多一少”，即多饮、多尿、多食及消瘦；二是并发症造成的症状，如糖尿病肾病、视网膜病变等。糖尿病分I型糖尿病和II型糖尿病。其中I型糖尿病多发生于青少年，其胰岛素分泌缺乏，必须依赖胰岛素治疗维持生命。II型糖尿病多见于30岁以后中、老年人，其胰岛素分泌不足。

目前糖尿病发病迅速，其已经成分为继肿瘤、心脑血管病之后第三位严重危害人类健康的慢性疾病。2009年10月21日国际糖尿病联合会(IDF)公布最新数据：目前患糖尿病的人数为2.85亿，如果这种发展趋势得不到遏制，到2030年这个数字预计将上升到约4.4亿。IDF的糖尿病地图(Diabetes Atlas)最新数据表明中低收入国家(LMC)人民正受到糖尿病蔓延的冲击，而且工作年龄段的糖尿病患者要比原来预料的多得多。我们成为继印度(5080万)之后发病人数最多的国家(4320万)。糖尿病者需终生给药，因此开发高效低廉的糖尿病新药具有诱人的前景。

GLP-1是一种主要由远端回肠、直肠和结肠的L细胞分泌的多肽激素。具有刺激胰岛素分泌和生物合成、增加胰岛β细胞数量、抑制胰高血糖素分泌和抑制胰岛β细胞凋亡等作用。GLP-1降血糖活性最大的特点是葡萄糖浓度依赖性降糖，不会引起低血糖。因此其具有很大的应用前景。由于其在体内受DPPIV酶的降解，在体内的半衰期只有2-3min。因此寻求一种延长GLP-1体内半衰期，延长其生物活性的方法，成为目前GLP-1研究的热点。

目前国内外对GLP-1治疗糖尿病的研究方向之一是对其结构进行改变，得到GLP-1衍生物，用该衍生物治疗糖尿病，达到延长药物在体内药效时间的目的。例如诺华诺德公司研制的NN2211(商品名Liraglutide)，其在GLP-1的Lys26上进行酰化，可以显著提高GLP-1的体内半衰期。也有人在C端接上脂肪酸以与血浆白蛋白结合，从而增加其在体内的稳定性。

这些改变与天然GLP-1相比半衰期显著延长，但是这些衍生物仍然存在着制备和纯化困难，半衰期不够长的问题，并且这些衍生物都是局限于注射给药，不能应用于口服给药。本发明对GLP-1结构进行改变，提供一种tGLP-1结构，可以增强其抗蛋白酶降解的能力，从而有效地提高半衰期。由于口服给药需药量较大，因此，本发明同时采用基因串联的方法来大量表达蛋白。另外pET载体系统常用乳糖类似物异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)诱导，但IPTG具有潜在的毒性，对菌体生长有一定的抑制作用，且价格昂贵，而本发明采用乳糖代替IPTG的方法，利用自诱导培养基表达外源蛋白，使得细菌在该培养基中的表达量显著得以提高。

发明内容

本发明所涉及的GLP-1是指GLP-1(7-37)，其氨基酸序列(Seq ID No.1)如下：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。

本发明的目的之一是提出一种GLP-1衍生物，即tGLP-1，其特征在于，所述tGLP-1的分子结构式为tGLP-1(7-38)，Seq ID NO.2；其中，Xaa2是Ser；Xaa20是Gln；Xaa28是Asp；Xaa30是Thr，Asp，Ser，Ala，Gly，Leu，Gln，His中的任何一种；Xaa32是Cys。

本发明的tGLP-1，是指以上位点的氨基酸经过本发明改造后的GLP-1蛋白。

本发明的tGLP-1衍生物将体内蛋白酶DPP-IV酶切位点突变，将胰酶酶切位点突变，使其既可以抵抗DPP-IV的降解又可以抵抗胰酶的降解，从而延长其在人体内的半衰期。