[发明专利]一种检测感染马铃薯的病毒的方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测感染马铃薯的病毒的方法及其专用引物。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR反应类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成，即在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。通过PCR，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，PCR已广泛应用于生物检测和疾病诊断等领域。

多重PCR是在普通PCR的基础上加以改进，原理与常规PCR基本相同，只是在一个PCR反应体系中加入两对以上引物，针对多个模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。

在上述两种PCR反应中，引物设计的好坏直接影响检测的特异性和灵敏度。然而，传统的PCR体系中，引物二聚体的形成以及引物与模板的错配严重制约PCR技术的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测感染马铃薯的病毒的方法及其专用引物。

本发明提供了辅助检测感染马铃薯的病毒的专用引物，包括如下五对引物中的至少一对：

引物对I：序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；

引物对II：序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列组成的引物对；

引物对III：序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列组成的引物对；

引物对IV：序列表的序列7和序列表的序列8所示核苷酸序列组成的引物对；

引物对V：序列表的序列9和序列表的序列10所示核苷酸序列组成的引物对；

所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯V病毒或烟草环斑病毒。

所述专用引物具体由所述引物对I、所述引物对II、所述引物对III、所述引物对IV和所述引物对V组成。

所述专用引物可应用于辅助检测感染马铃薯的病毒；所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯V病毒或烟草环斑病毒。

所述专用引物可应用于制备辅助检测感染马铃薯的病毒的试剂盒；所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯V病毒或烟草环斑病毒。

本发明还保护一种辅助检测感染马铃薯的病毒的试剂盒，它包括所述专用引物；所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯V病毒或烟草环斑病毒。

所述试剂盒可应用于辅助检测感染马铃薯的病毒；所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯V病毒或烟草环斑病毒。

本发明提供了辅助检测待测生物样本中含有哪种或哪几种感染马铃薯的病毒的方法，所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯V病毒或烟草环斑病毒，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

以待测样本的cDNA为模板，任一所述专用引物进行PCR，检测PCR产物；如果得到152bp的PCR产物，则待测样本中含有烟草花叶病毒；如果得到879bp的PCR产物，则待测样本中含有马铃薯X病毒；如果得到563bp的PCR产物，则待测样本中含有马铃薯Y病毒；如果得到615bp的PCR产物，则待测样本中含有马铃薯V病毒；如果得到343bp的PCR产物，则待测样本中含有烟草环斑病毒。

所述方法中，所述PCR的反应参数为：94℃、15min；94℃、30sec，60℃、30sec，72℃、70sec，34个循环；72℃、10min。

检测烟草花叶病毒(CMV)的引物序列为：

CMV-f：5’-GCGCATTCAAATTCGAGTTAATIIIIIGCCGAAAT-3’(序列1)；

CMV-r：5’-GCATACTGATAAACCAGTACCGGTIIIIITCCGTCCG-3’(序列2)。

目的条带为152bp。

检测马铃薯X病毒(PVX)的引物序列为：

PVX-f：5’-ATCCCTTTGGACCTGCTTAGIIIIIGAGACTACGG-3’(序列3)；

PVX-r：5’-TTTCCCAGAAGGCCGAAGIIIIIGCACTTGTGTTC-3’(序列4)。

目的条带为879bp。