[发明专利]抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv的编码基因，其特征在于其编码基因序列为SEQ ID No.2所示。

3.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv的重组载体，其特征在于，载体为pET26b(+)-ScFv，其含有SEQ ID No.2所示基因序列。

4.一种抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于以下步骤实现：

1)合成抗原；以蛋白BSA合成免疫用抗原，动物注射免疫Bab/C小鼠，以OVA合成包被用抗原；

2)建立杂交瘤细胞株McGill078；获得免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，阳性克隆筛选后，获得杂交瘤细胞株McGill078，将杂交瘤细胞株McGill078进行培养、传代，重悬后接种于小鼠腹腔，10天后待腹部膨胀后采集腹水15ml；而后采用快速批次吸附法纯化鼠腹水中的抗呕吐毒素抗体，经测定单克隆抗体的浓度为9.2mg/ml，抗体类型为IgG1(γ₁，κ)，具有抗原特异性和抗原亲和力；

3)抗呕吐毒素DON单克隆抗体ScFv的重链、轻链可变区基因克隆

取2×10⁶个对数生长期的McGill078杂交瘤细胞，采用Trizol试剂提取总RNA，分离纯化mRNA；利用Invitrogen试剂盒，以Oligo(dT)20为引物，RT-PCR逆转录合成cDNA；通过PCR方法以特异性引物扩增轻链可变区基因、重链可变区基因；1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试验盒回收片段，T A克隆插入pMD18-T载体，获得抗呕吐毒素DON单克隆抗体ScFv的重链、轻链可变区基因；

4)单链抗体ScFv的构建与表达

ScFv的构建，采用重叠延伸法SOE用编码亲水性多肽接头(G4S)₃将克隆的抗体轻、重链可变区基因连接，构成5’VH-Lingker-VL3’形式；ScFv与表达载体pET26b(+)经限制性内切酶BamHI、HindIII酶切后，T4连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10F`中进行表达，进而针对以包涵体IBS形式表达ScFv表达系统，进行IPTG诱导表达；

5)单链抗体ScFv的纯化与变性复性，获得单链抗体ScFv；

pET26b(+)-ScFv转化进入TOP10F`，IPTG诱导表达，收集包涵体沉淀，冰浴超声破碎，在菌体裂解物中加入质量体积百分比为1％的triton X-100，20000g离心30分钟，上清液过滤膜，尿素溶解备用，Ni²⁺-IDA His-bind亲和层析纯化蛋白，稀析法和透析法对目的蛋白复性，纯化的蛋白稀析到复性缓冲液I：50mM Tris-HCL、0.15mMNaCl、2M urea、0.5mM还原型谷胱甘肽、0.1mM氧化型谷胱甘肽、pH8.0，调节复性缓冲溶液I终浓度为100μg/ml，复性24小时后，将蛋白装入复性缓冲液II：50mMTris-HCl、0.15mMNaCl、pH8.0，透析复性12小时，浓缩蛋白，获得单链抗体ScFv。

5.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中特异性引物为：

重链上游引物：VHF：5’-ATGGCCCTCGAGGTGAAGCT-3’

重链下游引物：VHB：5’-TGAGGAGACGGTGACTGAGG-3’

轻链上游引物：VKF：5’-GACATTGTGATGACACAGTC-3’

轻链下游引物：VKB：5’-GCTCCAGCTTGGTCCCCCCT-3’。

6.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中抗体重链可变区，具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中抗体重链可变区基因，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求4所述的抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于其中抗体轻链可变区，具有SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。