[发明专利]抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv及其制备方法与应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv及其制备方法，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述基因和多肽的制备方法，属生物制品领域。

背景技术：

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，主要是由镰刀菌产生的次级代谢产物之一的单端孢霉烯族毒素，主要产毒菌是禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌等。目前被认为是存在于赤霉病小麦中的主要天然毒素之一。它可引起人畜中毒，因其广泛的存在并大量污染粮食，对人畜构成很大危害。联合国粮农组织和世界卫生组织1973年联合召开的第三次食品添加剂和污染物会议上，单端孢霉烯族毒素被定为最危险的自然发生食品污染物，列入国际研究的优先地位。DON化学性能稳定，具有较强的热抵抗力和耐酸，具有广泛的毒性，特别是对免疫功能具有明显的影响，根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。

DON是全世界饲料和粮食的污染霉菌毒素之一，也是我国恶性肿瘤高发区居民粮食主要污染霉菌毒素之一，在我国北方食管癌高发区日常主食中高水平的普遍存在，而且这些毒素可能在食管癌形成中具有一定作用。我国在对江苏、安微、河南、甘肃、江西、贵州、上海赤霉病毒流行区小麦作DON、玉米赤霉烯酮的调查发现安徽小麦中DON含量最高达4,000g/kg，平均含量340g/kg；甘肃小麦受DON污染最严重，平均污染量达2,050g/kg，最高含量达20,000g/kg。小麦中玉米赤霉烯酮的污染，江苏最高约51g/kg、安徽为32g/kg、河南为8g/kg、甘肃为15g/kg、江西为6g/kg、上海为11g/kg。我国安徽，甘肃等地谷物中DON污染量严重超标。

DON的污染常出现于小麦和玉米中，因此绝大部分DON检测方法是针对这些物质。DON的分离检测可用多种不同的方法，如薄层色谱法、酶联免疫吸附试验、气相色谱、高效液相色谱、超临界流体色谱法和毛细管电泳色谱等。各有其优点与不足：如TLC法的精确度低，操作过程复杂，分析结果的可重复性和再现性差；仪器方法具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点但样品前处理复杂耗时；酶联免疫法优点是快速、灵敏、高通量，但抗体价格影响较大，抗体制备时间长，作为一种较为准确的快速筛查方法，抗体的制备的分子生物学研究已成为国内外研究热点。

目前尚无有效药物治疗霉菌毒素中毒，抗菌素的解毒效果并不明显，而且会造成药物的残留与抗性等毒副作用。免疫治疗方法，因抗体的种间异源性及分子量过大造成宿主的防御性反应，而单链抗体ScFv则可以避免上述治疗难题；ScFv是具有完全抗体结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的1/6，具有以下优点：(1)保持了抗体的特异性，大大减少了免疫原性；(2)组织穿透力强，分子量小，易进入靶标实体的微循环，且体内清除也较快；(3)无Fc段，可作为导向载体，以酶或细胞因子及药物连接构建双功能抗体，利于治疗与诊断；(4)易于基因操作和基因工程的大量生产；(5)可在多种不同的原核、真核表达系统中表达，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物细胞等表达系统。

目前关于呕吐毒素DON单链抗体ScFv的研究国内外未见报道，相关专利的申请国内外亦未见报道。

发明内容：

本发明针对以上现有技术存在的缺点，针对抗体杂交瘤细胞株在大规模生产上容易突变，细胞株不稳定，基因易丢失，代价昂贵等诸多缺点，本发明应用基因工程手段，提供了一种抗呕吐毒素DON的单克隆抗体重链和轻链可变区基因及所编码的多肽，重组后表达出特异性识别和结合呕吐毒素DON的抗体活性片段，使大规模廉价生产抗体成为可能。

本发明的另一个目的在于：单链抗体ScFv片段在制备用于呕吐毒素DON残留检测试剂中的应用，为后续人源化改造及免疫治疗呕吐毒素DON中毒提供新的途径。

本发明的目的是这样实现的：为了解决上述的技术问题，发明人从一株单克隆抗体的杂交瘤细胞株(定名为McGill078)，通过PCR方法克隆得到抗体的重链与轻链可变区基因，其主要的步骤为：从杂交瘤细胞株McGill078中用Trizol(Invitrogen)试剂提取总RNA，分离纯化mRNA(PolyATtract mRNA Isolation Systems，Promega)，按照Invitrogen试剂盒(SuperScript III First-Strand Synthesis Systen for RT-PCR)，以Oligo(dT)20为引物，RT-PCR逆转录合成cDNA，然后以设计特异性引物扩增VL和VH基因。其中，扩增VH的引物为：

VHF：5’-ATGGCCCTCGAGGTGAAGCT-3’