[发明专利]一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种基于液相色谱质谱技术开发的全血中他克莫司定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱质谱技术对全血中他克莫司进行高灵敏度定量检测的方法。

本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。

背景技术

他克莫司(tacrolimus，简称FK506)是从链霉菌属培养物中分离得到的大环内酯类新型免疫抑制剂，能有效抑制T淋巴细胞激活。FK506与内源性细胞受体结合，形成一个亲免素复合物，从而发挥药理作用。目前FK506已在肝、肾、心、胰等器官移植中广泛用于抗排斥及自身免疫系统相关疾病的治疗。FK506的血药浓度与免疫抑制强度和毒副反应相关，不仅治疗窗窄而且药动学个体差异大，临床使用FK506需要进行血药浓度监测。

目前临床常规监测FK506全血浓度的方法主要有微粒子捕捉酶免疫发光技术(microparticle enzyme immunoassay，MEIA)和酶联吸附免疫分析技术(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。ELISA法和MEIA法对体内FK506及其代谢产物产生交叉免疫反应，使实际测得结果为FK506及其代谢物之和。

液相色谱质谱技术(LC-MS/MS)是近年来迅速发展的定量分析技术，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内药物分析、新生儿遗传疾病筛查和药物代谢研究等领域的实用方法。研究开发一种结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的FK506血药浓度的LC-MS/MS检测试剂盒，使其能广泛应用于我国FK506临床研究和常规血药浓度监测中，将有助于提高FK506检测质量、促进检测方法标准化和规范化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒，以满足他克莫司临床血药浓度监测和大规模临床研究的需要。

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。

技术方案

本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定人全血样本中FK506浓度的新型试剂盒。试剂盒以子囊霉素为内标，先用硫酸锌溶液处理全血样本，然后用乙腈沉淀，取上清液进行LC-MS/MS检测，记录FK506和内标的峰面积。采用内标法，根据待测样本中的FK506/内标峰面积比值即可计算出FK506浓度。测定结果为全血样本中FK506浓度。

本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤：

1.他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制：精密称取5mg他克莫司对照品，置10mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，配制成0.5mg/mL的他克莫司储备液。精密量取他克莫司储备液0.5mL，置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，配制成5μg/mL的他克莫司母液。分别精密量取他克莫司母液0、0.01、0.03、0.1、0.3、0.5mL，分别置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，所配制他克莫司标准曲线样本浓度分别为0、1、3、10、30、50ng/mL，分装，贴签标记，完成操作。分别精密量取他克莫司母液0.025、0.1、0.4mL，置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，所配制他克莫司质控样本浓度分别为2.5、10、40ng/mL，分装，贴签标记，完成操作。

2.样本处理液的配制：精密称取14.38g ZnSO₄·7H₂O，置500mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即为100mmol/L硫酸锌溶液，分装，贴签标记，完成操作。

3.内标液的配制：精密称取1mg子囊霉素对照品，置50mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，配制成20μg/mL的储备液， 精密量取上述子囊霉素储备液1mL，置1000mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，即为20ng/mL子囊霉素溶液，分装，贴签标记，完成操作。

4.流动相调节液的配制：精密称取38.5g乙酸铵，置500mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即为1mol/L乙酸铵溶液，分装，贴签标记，完成操作。

本发明的试剂盒使用方法如下：

精密取全血样本100μL置1.5mL EP管中，加入样本处理液100μL，再加入内标液300μL，涡流混匀2min，静置30min，离心5min(12000rpm)，取上清液进样20μL进行LC-MS/MS定量分析。

有益效果