[发明专利]一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法，属于生物 细胞活性检测技术领域。

背景技术

细胞活性和毒性检测在细胞生物学、细胞毒理学、药物研发等领域应用极 其广泛，是生物学、医学中重要的技术和手段。近年来，根据细胞死亡过程中 的各个状态的细胞特性变化，建立了多种细胞活性检测方法。常规细胞活性检 测方法主要有细胞计数法、台盼蓝拒染法、中性红染色法、四噻唑蓝(MTT) 比色法、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测等方法。在细胞活性检测过程中，显 微镜、酶标仪和流式细胞仪等仪器发挥着重要的作用。

显微镜观察是推动细胞生物学发展的技术手段，也是细胞活性检测的基本 手段。而荧光显微镜的使用，使得这种技术手段在细胞活性检测方面发挥了更 大的作用。运用显微镜观察来检测细胞活性，通常是将细胞染色、制片后，显 微镜直接观察、拍照。该方法是通过肉眼观察，从形态学或染色程度分辨活细 胞或死细胞，人工判断细胞的染色程度和数目，借此判断细胞的活性。但是， 这种方法主要依靠人眼的主观判断，易引起较大的人为误差。

酶标仪检测是根据细胞群体染色后的吸光值大小判断细胞活性。其中的四 噻唑蓝(MTT)比色法是进行细胞活性判断的常用方法。MTT染料被活细胞摄 取后，可被线粒体脱氢酶氧化生成紫色结晶，其生成量与活细胞数成正比。MTT 法利用测量组的吸光度值与对照组相比得出的百分率作为所测细胞的存活率， 表征细胞活性。此外，还有利用活细胞染料进行染色的方法，细胞群体染色后 的吸光值与活细胞数目成正比，根据吸光值的差异可判断活细胞的数目，从而 得出细胞群体的相对活性。该方法的不足是仅考虑了活细胞的数目，而不能结 合更多因素测定细胞活性。

流式细胞术是现代细胞分析检测技术。可高速分析上万个细胞，快速实现 细胞活性检测，并可同时从一个细胞中测得多个生物化学参数。但是流式细胞 仪价格昂贵，实验成本很高，非普通从事生物学研究的科研和医疗单位所能拥 有。而且，由于流式细胞仪仪对人员操作的技术要求高，使其大规模的应用难 以实现。

现代微量分析技术毛细管电泳是通过样品组分在μm级内径的毛细管通道 内进行电泳，因组分具有的荷质比差异实现彼此分离。毛细管电泳具有高效、 快速、仪器成本和实验费用低等明显优势。在生物、医药和临床等研究中，毛 细管电泳已广泛用于生物大分子(蛋白质、核酸等)，有机小分子和无机离子等 的分析检测，并可用于细胞内的成分分析。毛细管电泳在生物学、医学、药学、 环境科学等研究领域具有广泛的应用，是分析化学的前沿和热点。

目前，已有连续流毛细管电泳应用于细胞活性检测的方法报道。例如，文 章“Continuous intact cell detection and viability determination by CE with dual-wavelength detection，Electrophoresis”(DOI 10.1002/elps.200900417，2010， 31：1-7)介绍的方法，该方法使单细胞连续地通过毛细管检测窗口，使用紫外 -可见双波长检测细胞，其对细胞活性的检测与表征已经过MTT和台盼蓝染色 两种常用方法的验证，结果准确。但是，该方法在实施时，由于单细胞连续电 泳模式的实现依赖于细胞浓度，不易实现，导致对细胞活性的检测较难实施。 此外，数据处理过程复杂，数据分析较为耗时。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛细管区带电泳结合二极管阵列检测器检测细 胞活性的方法，以克服现有方法存在的人为误差，仪器设备昂贵、实验成本高， 不适合高通量分析等不足，实现准确、快速、简便、成本低且可定性定量检测 细胞活性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法，包括以下步骤：

步骤一、为使毛细管区带电泳能够对细胞活性进行检测，先对待测细胞样 品进行预处理。即，用细胞染料将待测细胞染色，离心后，弃去上清液，再加 入磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，直至将残留细胞染料洗净为止。之后，向清 洗后的细胞沉淀中加入细胞固定液，由此对细胞进行固定化处理，固定化反应 温度优选为15-30℃，细胞固定液和固定时间可根据染料特点和细胞性质进行选 择。最后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，直至除去剩余的细胞固定液。