[发明专利]基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法

权利要求书

1.一种利用基因枪方法培育油菜叶绿体转基因的方法，其步骤包括培养基制备，引物设计、PCR扩增、载体构建和遗传转化，其特征在于，以油菜子叶为外植体，通过基因枪法将油菜叶绿体特异性表达载体导入受体油菜中，通过筛选及鉴定，得到叶绿体转化植株，其步骤如下：

1)引物设计和载体构建：根据Genebank公布的拟南芥叶绿体基因组序列(登录号为NC000932)，设计两对特异引物对F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA，以油菜叶绿体基因组为模板，用所述的引物对F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA扩增trnI和trnA基因片段，测序后作为同源重组片段，从质粒p-aadA中分别用SmaI和EcoRV酶切获得筛选标记基因aadA，其序列如SEQ ID NO：X所示，调控序列，其序列如SEQ ID NO：Y所示，从质粒p-Prrn中分别用SpeI和XhoI酶切获得启动子Prrn，从质粒p-TpsbA中分别用SmaI和EcoRV获得终止子TpsbA，将所述的同源重组片段、启动子、筛选标记基因和终止子连接到载体pBluescript上，构建得到油菜叶绿体特异性表达载体pCL318-5；所述的特异引物对F-trnI、R-trnI、F-trnA和R-trnA的DNA序列如下所示：

F-trnI：5’-ATAGAGCTCTGGAACCCTGAACAGACTG-3’，

R-trnI：5’-ATAGCGGCCGCATTTGAACCAGAGACCTC-3’；

F-trnA：5’-ATAGTCGACGGGGATATAGCTCAGTTGG-3’，

R-trnA：5’-TAAGGGCCCCGGTACTACTTCGCTATCG-3’；

2)应用基因枪方法转化油菜子叶，它包括以下步骤：

1)外植体的获得：取饱满油菜种子经表面消毒后接种至B5基本培养基上，在25℃，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下生长4d，然后将子叶切下，黑暗条件下高渗？预处理4h；

2)基因枪转化及筛选：将步骤1)的油菜子叶，进行基因枪轰击，每皿轰击2次，轰击后在黑暗条件下用B5培养基中恢复培养16h；

3)愈伤组织的诱导及筛选：将恢复培养后的油菜子叶切成3mm×3mm的块状，转入附加10mg/l壮观霉素的愈伤诱导培养基B5D-5S上，于25℃，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下诱导愈伤组织，每两周继代培养一次，共继代培养4次；

4)愈伤组织的分化诱导：将步骤3)的绿色抗性愈伤组织接种到附加20mg/l壮观霉素的分化培养基BF3S上，于25℃下，2000Lux，16h光照/8h黑暗条件下培养至分化出绿色小芽，得到候选转基因苗； 

5)再生芽的生根诱导：将步骤4)的得到的材料，在生根培养基B5-N上和壮苗培养基B5上培养，筛选获得候选转基因植株；

6)采用PCR、Southern方法检测PCR阳性株系，获得转基因植株。

其中

所述的培养基成分如下所述：

发苗培养基B5：

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂^·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨酸10mg/L，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.5；

预培养培养基B5-Y

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂^·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨酸10mg/L，0.4mol/L甘露醇，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.5；

愈伤组织诱导和筛选培养基B5D-5S：

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂^·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨10mg/L，2，4-D 0.6mg/L，KT 0.2mg/L，壮观霉素10mg/L，AgNO₃ 3mg/l，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH5.5；

分化和筛选培养基BF-3S

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂^·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨10mg/L，6-BA 1mg/L，KT 1mg/L，NAA 0.5mg/L，壮观霉素20mg/L，AgNO₃ 3mg/l，蔗糖 30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.5；

生根培养基B5-N：

KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134mg/L，MgSO₄^·7H₂O 250mg/L，CaCl₂^·2H₂O 150mg/L，NaH₂PO₄^·H₂O 150mg/L，EDTA-Na铁盐43mg/L，MnSO₄^·H₂O 10mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，ZnSO₄^·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄^·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄^·5H₂O 0.025mg/L，KI 0.75mg/L，CoCl₂6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B6 1mg/L，半胱氨10mg/L，NAA 0.1mg/L，壮观霉素10mg/L，蔗糖30mg/L，琼脂7g/L，补充水分至1L，灭菌前调pH至5.5。